基因表達(dá)的檢測(cè)ppt課件-展示頁
2025-05-16 00:16本頁面
【正文】 0 181。C烘烤 3hrs以上；塑料制品 DEPC水清洗，蛋白質(zhì)變性劑處理；一次性用品如 tube, tip等使用新的，無 RNA酶的產(chǎn)品。 用這種方法得到的總 RNA中蛋白質(zhì)和 DNA污染很少，可以用來做 Northern,RTPCR,分離 mRNA，體外翻譯和分子克隆等。 Trizol Reagent 提取方法： 利用 Trizol 試劑 抽提植物總 RNA Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總 RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持 RNA的完整性。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí) RNA的簡(jiǎn)易制備過程，通過 RNA電泳帶評(píng)價(jià) RNA質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)材料： 水稻幼嫩葉片 ? 苯酚 /氯仿反復(fù)抽提 ，價(jià)廉但質(zhì)不優(yōu)，尤其是對(duì)多酚等含量高的材料不適 ? 蛋白酶 /SDS配合酚、氯仿抽提的方法 ? 強(qiáng)變性劑法。 RNA EXTRACTION (mini prep) RNA的制備與分析對(duì)于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)和 cDNA的合成都是必須的， RNA的純度和完整性對(duì)于 Northern blot, RTPCR和 cDNA文庫的構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。用來使 RNA酶不發(fā)揮作用的RNA酶抑制劑主要有： 1. DEPC(Diethylpyrocarbonate) 或DMDC(Dimethyldicarbonate) 2. 氧釩核糖核苷復(fù)合物 3. RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑 DEPC: 是高度活性的烷基化試劑，通過組胺基團(tuán)乙氧基甲酸化形式破壞 RNase的活性 O C C O O CH2CH3 CH2CH3 氧釩核糖核苷復(fù)合物 : 能與多種 RNA酶活性位點(diǎn)結(jié)合并幾乎百分之百地抑制 RNA酶的活性 RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑Ribonuclease Inhibitor 可與 RNase形成非共價(jià)的復(fù)合物，從而使 RNA酶失活。 防止外源 RNase污染的主要措施 (二）： 材料要新鮮 。 6. 180－ 300186。 實(shí)驗(yàn)原理 被污染的試劑，緩沖液 移液器 使用的器皿及 tip等 操作者的手，頭發(fā)等 RNA操作中應(yīng)注意的問題： 防止 RNase污染 外源 RNase的主要來源： 1. 當(dāng)處理 RNA時(shí)，移液器專用 2. 保證 RNA實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿、塑料制品和緩沖液等留出專用； 3. 溶液和試劑分裝成小份保存； 4. RNA電泳裝置專用（清洗、處理、 DEPC處理過的水沖洗）； 防止外源 RNase污染的主要措施 (一）： 5. 準(zhǔn)備所有的溶液和緩沖液時(shí)，使用無 RNA酶的玻璃器皿， DEPC處理過的水，用于 RNA的化學(xué)藥品使用專用藥勺或直接敲擊瓶底分離，可能的話，用 ％的 DEPC在 37186?；虮磉_(dá)檢測(cè) 第三部分： RTPCR (Reverse transcription PCR) Reverse Transcription PCR RNA抽提 cDNA 反轉(zhuǎn)錄 基因特異性引導(dǎo) Oligo(dT)引導(dǎo) 隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo) PCR Northern Blotting 基因表達(dá)分析 Northern Blotting ?Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993. 基因表達(dá)水平 （梁大成等， 2022） 表達(dá)增強(qiáng)克隆的 RTPCR和 Northern雜交分析 ladder c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 c 1 3 5 7 EI12I1 EI22F22 EI1K8 EI35I3 223。actin A B C D
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