基因表達(dá)的檢測(cè)ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-03 00:16 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 沒(méi)有完全溶解 RNA降解的主要原因 取樣后沒(méi)有立即抽提 RNA； 抽提過(guò)程中超作不當(dāng)，樣品量超過(guò)了許可的范圍； 樣品運(yùn)輸、保藏不當(dāng)，或 RNA保藏不當(dāng)，應(yīng)放入 70 ℃ ，而不是 20 ℃ ） 使用的溶液或器皿有 RNase污染 瓊脂糖變性膠（甲醛）電泳時(shí) pH值低于 DNA污染的原因 ? 樣品太多，所加試劑相對(duì)太少 ? 用來(lái)分離 RNA的樣品中含有機(jī)溶劑（乙醇， DMSO等），或堿溶液等 RTPCR (Reverse transcription PCR) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí) RTPCR的原理及其操作過(guò)程 實(shí)驗(yàn)材料： 水稻幼嫩葉片 RNA 目前 PCR技術(shù)只能擴(kuò)增 DNA模板，對(duì) RNA模板不能直接擴(kuò)增。 mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA可作為 PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，這種在 mRNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行的 PCR擴(kuò)增稱為RTPCR。 RTPCR比 Northern雜交更靈敏，對(duì) RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡(jiǎn)便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)基因時(shí)空表達(dá)的常用方法。 實(shí)驗(yàn)原理 DNase I: 是將單鏈或雙鏈 DNA同等程度的隨機(jī)分解，生成具有 5‘－ P末端寡核苷酸的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。 Mg2+存在時(shí)，能在雙鏈上產(chǎn)生切口；而 Mn2+存在下能將雙鏈 DNA同時(shí)切斷，使 DNA片斷化。 活性定義：以小牛胸腺 DNA為底物，在 25176。 C、 ， 1分鐘內(nèi)使反應(yīng)液的 260nm吸光度增加 為 1個(gè)活性單位。 用途： 1. 與 DNA Polymerase I一起用于切口平移 2. 體外轉(zhuǎn)錄后除去模板 DNA 3. Mn 2+ 存在下為鳥(niǎo)槍法測(cè)序（ shot gun sequencing) 制作 DNA文庫(kù) 4. 用于足跡法（ foot printing)分析 DNA蛋白質(zhì)相互作用 單鏈多肽，具有聚合酶和較弱的 RNase H活性（或 RNase H－ ），最適反應(yīng)條件： 37 176。 C, , 反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于 RNA的 DNA聚合酶 鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶 MMLV： 禽成髓細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄酶 AMV 2條多肽鏈，具有聚合酶活性和較強(qiáng)的 RNase H活性，最適反應(yīng)條件 4145 176。 C， 性高 RNase H： 催化 DNARNA雜合體的 RNA部分的降解，產(chǎn)生不同鏈長(zhǎng)帶 3‘羥基和 5’磷酸末端的寡核苷酸。 Ribonuclease Inhibitor 單一多肽，可與 RNaseA形成 1： 1非共價(jià)的復(fù)合物，從而使 RNA酶失活。不能在變性劑如 SDS、胍等存在的情況下使用?；钚员磉_(dá)需要巰基化試劑（ DTT） 本實(shí)驗(yàn)以水稻葉片 RNA為材料，檢測(cè) β actin基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照：不加模板RNA，主要是消除 DNA及 PCR試劑方面引起的假陽(yáng)性；同時(shí)以葉片 DNA為陽(yáng)性對(duì)照，檢驗(yàn) PCR試劑和擴(kuò)增過(guò)程是否有問(wèn)題 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 操作步驟（一） RNA Preparation 1. Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent. 2. Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 ?g / ?l by DU640. . 3. Combine the following in a ml sterile eppendorf tube: Total RNA 3?l (25?g) RNasefree DNase ? １ ?l (１ u / ?l) 10 DNase ? buffer 1 ?l add DEPCtreated ddH2O 5 ?l 4. Incubate at 37℃ for 15 min, then 70℃ for 10 min. 操作步驟（二） Reverse Transcriptase Reaction
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