基因表達(dá)的檢測(cè)ppt課件-資料下載頁
2025-05-07 00:16本頁面
【正文】 Thermal Cyclers ? PCR machine available from many suppliers. ? Many block formats and multiblock systems. ? Reactions in tubes or 96well microtitre plates. 1. 在冰上配制下列反應(yīng)體系 : First strand cDNA 1 ?l TaKaRa Ex Taq (5 u / 1 ?l) ?l 10 Ex Taq buffer 2 ?l dNTP mixture (2 mM) 2 ?l Primer F (10 mM) ?l Primer R (10 mM) ?l ddH2O ?l 混勻后 ， 短暫離心 ， 每管加一滴礦物油 。 操作步驟（三） PCR 3. PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置： 根據(jù)引物及基因的表達(dá)水平設(shè)置循環(huán)參數(shù)：如引物序列、引物長(zhǎng)度、擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度及mRNA 的豐度等 4. 檢測(cè)：加 2 ?l溴酚藍(lán) ， 混勻 ， 取 15 ?l反應(yīng)產(chǎn)物電泳； 5. 在 1%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳； EB染色，紫外觀察。 RT ? 反應(yīng)程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 27 CYCLES. Genome: 750 bp cDNA: 250 bp ? 2KB cDNA ZH11 H2O GAL4 ? 反應(yīng)程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 30 CYCLES. Size : 630 bp 1. Taq酶過多； 2. Mg2+濃度不合適； 3. 引物濃度過高或設(shè)計(jì)不合理； 4. 復(fù)性溫度過低； 5. 循環(huán)次數(shù)過多； 6. 模板量過多； PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶的可能原因： PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè) Optimising the Annealing Temperature ? Primers have a calculated annealing temperature (. 54 ℃ ). ? Temperature must be confirmed practically. ? Temperature steps of 2 ℃ above and below. ? Use gradient cycler. Optimising the Mg2+ Concentration ? The fidelity of the PCR depends on [Mg2+]. ? Optimize [Mg2+] in a ladder of mM. ? Sometimes a promise between yield and specificity. 引物問題 引物濃度過高：與模板錯(cuò)配，非特異擴(kuò)增；產(chǎn)生引物二聚體 引物長(zhǎng)度：一般 18－ 28 bp； GC含量約 50－ 60％ 配對(duì)引物的 Tm值要相當(dāng) 引物 3’端應(yīng)盡量避免互補(bǔ)，以免產(chǎn)生引物二聚體 引物 3’端 3個(gè)或 3個(gè)以上的 GC，容易結(jié)合到基因組GC豐富區(qū)域，導(dǎo)致錯(cuò)誤擴(kuò)增 1. 點(diǎn)樣或染膠問題 2. 反應(yīng)體系中忘記加入某種成分 (無擴(kuò)增產(chǎn)物 ） 或分裝 mixture時(shí)出了問題； 3. 目的片段太大 ， 使用的 DNA Polymerase 無法擴(kuò)增出目的片段； 4. DNA溶液中或反應(yīng)體系中含有 Taq 酶抑制劑 ， 抑制了 Taq DNA聚合酶的活性 。 5. 退火溫度太高； 6. Taq 酶活力不夠或其他試劑有問題； 7. 引物設(shè)計(jì)不合理 ， 與模板不配對(duì)等 。 導(dǎo)致 PCR產(chǎn)物很少或無擴(kuò)增產(chǎn)物的原因 凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物時(shí)，目的擴(kuò)增帶很弱或看不到目的擴(kuò)增帶，應(yīng)從以下幾個(gè)方面尋找原因：
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