【正文】 ：其所含 的 酶 在低溫能有效地催化生化反應(yīng)；在低溫下主動運(yùn)輸 仍能正常進(jìn)行，有效的吸收必須的營養(yǎng)物質(zhì)，是其 原生 質(zhì)膜中含有較多的不飽和脂肪酸 ，在低溫下仍可維持膜 的 流動性 。 環(huán)境因素對微生物生長的影響 一、溫度 溫度太低：使原生質(zhì)膜處于凝固狀態(tài)，不能正常進(jìn)行 營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸或形成質(zhì)子梯度。 三、連續(xù)培養(yǎng) （一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) ： 分批培養(yǎng) ：指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng) 過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的培養(yǎng)方式。 絲狀微生物的群體生長 ：絲狀生長和沉淀生長兩種方式。 （ 3）功能：產(chǎn)生 次生代謝產(chǎn)物 （抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了 連續(xù)培養(yǎng)技術(shù) 。 （ 1）特點(diǎn)：新生的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞數(shù)目相等、總菌數(shù)達(dá)到最大值、 代謝活力鈍化 。 （ 1）特點(diǎn)： 分裂速度最快 、 代時最短 、 代謝活動旺盛 、 對環(huán)境變化敏感 。 （ 2）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底物的酶。如 設(shè)法縮短遲緩期、延長對數(shù)期以及在穩(wěn)定期收集菌體。 ? 生長曲線的不同時期反映的是 群體 而不是單個細(xì)胞的 生長規(guī)律。 微生物群體生長的規(guī)律 ? 生長曲線代表在新的適應(yīng)環(huán)境中生長、分裂直至衰老、死亡全過程的動態(tài)變化規(guī)律。 常用的實驗菌和代表的致病微生物 實驗菌 代表的致病微生物 金黃色葡萄球菌 革蘭陽性球菌 枯草芽孢桿菌 革蘭陽性桿菌 恥垢分支桿菌 結(jié)核分枝桿菌 大腸埃希菌 革蘭陰性桿菌 白假絲酵母菌 酵母狀真菌 曲霉 絲狀真菌 噬菌體 病毒、腫瘤細(xì)胞 篩選方法 抗菌抗生素一般采用瓊脂擴(kuò)散法。 篩選模型： 是指篩選工作中所使用的實驗菌。 ? 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取 ， 點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng) ， 以進(jìn)一步篩選和分離 。 ? 通過高倍放大進(jìn)行鏡檢 ， 可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況 。 ? 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。 ? 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。 （ 1）前體物質(zhì) 某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物的分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高。 供給菌體生命活動所需要的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ) 碳源 （ 1）無機(jī)：氨水、銨鹽、硝酸鹽 （ 2）有機(jī)：玉米漿、豆餅粉、花生餅粉 氮源 構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分，酶的激活劑、抑制劑、調(diào)節(jié)滲透壓、調(diào)節(jié) ph，氧化還原電位 ? 磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物、鉀、鈉、鎂、鐵、銅、錳、鉬、碘、溴 ? 特點(diǎn)：需要量少，但作用重大 無機(jī)鹽 微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)：構(gòu)成細(xì)胞的組分、促進(jìn)生命活動的進(jìn)行。 工業(yè)發(fā)酵考慮原料價格問題。 培養(yǎng)基 是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的 ,按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。 ? 分離瓊脂平板制備好后 ， 一般皆應(yīng)在 37℃ 培養(yǎng)箱中存放 3天 。 ? 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮 ， 以抑制真菌的繁殖 。 培養(yǎng)基的組成原則 ? 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時間 、地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 采樣的對象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 三、新種分離與篩選的步驟 （ 一）采樣 采樣對象 以采集土壤為主 。 ? 發(fā)酵性能測定： 進(jìn)行生產(chǎn)性能測定 。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢 。 ? 定方案： 首先要查閱資料 ， 了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性 。 ? 實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌 ， 也必須重新進(jìn)行分離純化 。 生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位 、 高等院校 、 工廠或菌種保藏部門索取或購買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 。 采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生新抗生素 （ 1）基因克隆產(chǎn)生新抗生素：首先獲得某已知抗生素的結(jié)構(gòu)基因，然后通過一定的載體將基因片段導(dǎo)入特定的另一種抗生素產(chǎn)生菌中，則可能產(chǎn)生完全符合人們設(shè)計要求的新抗生素。 從已知的抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，經(jīng)篩選獲得新的半合成抗生素。 抗生素產(chǎn)生菌的分離和篩選 目前新抗生素的獲得途徑： 從自然界分離篩選新抗生素產(chǎn)生菌 從土壤到海洋；到極端微生物； 從微生物到植物、動物。 ? 細(xì)菌抗生素多是多肽類化合物。低濃度抑菌，高濃度殺菌。 ? 青霉素是一類群化合物，不同青霉素的側(cè)鏈 R各異。 ? 灰黃霉素抗真菌（皮膚病與灰指甲?。瑢?xì)菌無效。第一章 抗生素產(chǎn)生菌的菌種及培養(yǎng) 抗生素產(chǎn)生菌 ? 教材第一章、第一節(jié)： p119 ? 半數(shù)以上抗生素由放線菌產(chǎn)生，鏈霉菌， ? 真菌與細(xì)菌。 真菌抗生素 ? 真菌抗生素主要是青霉和產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生的青霉素，灰黃青霉產(chǎn)生的灰黃霉素。 ? 青霉素抗 G+菌有效，對 G菌作用很弱，對人的副作用小，有過敏反應(yīng)。常用青霉素 G， R為苯甲基。有的細(xì)菌產(chǎn)生青霉素酶，使酰胺環(huán)開裂而失去作用。如短桿菌的短桿菌素 S，枯草芽孢桿菌的枯草桿菌肽，多粘芽孢桿菌的多粘菌素等，對動物有毒性，只限外用。 改造現(xiàn)有的已知抗生素的產(chǎn)生菌，再經(jīng)篩選獲得新得抗生素產(chǎn)生菌。 采用新的篩選方法 如：應(yīng)用定向生物合成和突變生物合成的原理，以及培養(yǎng)超敏細(xì)菌以尋找微量的抗生素，選用新的腫瘤模型來篩選抗腫瘤的抗生素。 （ 2）沉默基因的激活： 引入抗生素生物合成的調(diào)控基因，有可能激發(fā)抗生素產(chǎn)生菌處于休眠狀態(tài)或沉默狀態(tài)的基因系統(tǒng)，從而開啟另一結(jié)構(gòu)抗生素的生物合成開關(guān)，得到新抗生素。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ， 快速 、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 。 ? 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 ? 采樣： 有針對性地采集樣品 。 ? 分離： 利用分離技術(shù)得到純種 。 這些特性包括形態(tài) 、 培養(yǎng)特征 、 營養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 一般園田土和耕作過的沼澤土中 ， 以細(xì)菌和放線菌為主 ， 富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 ， 酵母和霉菌較多 ， 如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi) 。 從自然界篩選 ? 采樣季節(jié)：以溫度適中 ， 雨量不多的秋初為好 。 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 ， 宜將樣品逐步分批寄回 ，以便及時分離 。 除嗜溫性放線菌外 ， 其他放線菌一般在培養(yǎng) 420天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落 。 ? 選擇性地添加抗生素 。 培養(yǎng)基選擇和配制原則 營養(yǎng)吸收的過程 微生物的營養(yǎng)活動是依靠外界分泌大量的酶，將周圍環(huán)境中大分子蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，借助于細(xì)胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營養(yǎng)物質(zhì)來實現(xiàn)。 培養(yǎng)基選擇和配制原則 培養(yǎng)基設(shè)計所要考慮的問題 為微生物生長繁殖、產(chǎn)物合成提供所需的物質(zhì)。 培養(yǎng)基設(shè)計的共同特點(diǎn) 碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子、水、氧氣 一、培養(yǎng)基的類型和用途 據(jù)來源 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基 主要成分或使用目的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 據(jù)生產(chǎn)工藝 孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基 二、培養(yǎng)基的選擇 據(jù)微生物的特點(diǎn)來選擇 細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌 據(jù)發(fā)酵方式選擇培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基 從生產(chǎn)實踐和科學(xué)試驗 種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基 從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料 價廉、來源豐富、運(yùn)輸方便 三、培養(yǎng)基的配制原則 1. 據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基 2. 營養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比 3. C/N 4. 滲透壓 5. PH 四、培養(yǎng)基成分配比的選擇 1. 參照前人所使用的某一類菌種培養(yǎng)基的經(jīng)驗配方 2. 結(jié)合菌種和產(chǎn)品的特性 3. 確定初始配方 4. 對碳源、氮、無機(jī)鹽、前體等種類和量進(jìn)行逐個單因子試驗 5. 觀察對菌體生長、產(chǎn)物合成的影響 6. 綜合考慮各種因素，得到適合的菌種配方 7. 對其結(jié)果加以驗證 8. 最終確認(rèn)最佳配方 四、培養(yǎng)基成分配比的選擇 對代謝途徑清楚的主要代謝產(chǎn)物，可以根據(jù)物料平衡加以確定 如：青霉素發(fā)酵 ? 微生物所需要的物質(zhì) 碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子、水、氧氣 ? 在發(fā)酵工業(yè)中、必須使用廉價的原料來配制培養(yǎng)基，并且盡量滿足以下要求 1. 消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率 2. 能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度 3. 能得到產(chǎn)物的最大速率 4. 副產(chǎn)品的得率最小 5. 價廉并且有穩(wěn)定的質(zhì)量 6. 來源豐富且供應(yīng)充足 7. 通氣和攪拌、提純、廢物處理等生產(chǎn)工藝較容易 8. 另外培養(yǎng)基的選擇還會影響發(fā)酵罐的設(shè)計 （ 1）糖 （ 2）脂肪 （ 3）醇、有機(jī)酸 （ 4）碳?xì)浠衔? 除此之外，酒精、有機(jī)酸、烷烴等含碳物質(zhì)越來越引起人們的重視。 （ 1）生物素 （ 2） VB2 （ 3）提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料：玉米漿、麩皮水解液、酵母膏 生長因子 與菌種特性和生物合成產(chǎn)物的代謝控制有關(guān)，但并不促進(jìn)菌體生長。 如：氨基酸、核苷酸、抗生素 （ 2）促進(jìn)劑、抑制劑 如：誘導(dǎo)物、表面活性劑 前體物質(zhì)和促進(jìn)劑 作用： 促進(jìn)生長發(fā)育 推遲菌體自溶 抑制了無用的代謝途徑 改變發(fā)酵液物理性質(zhì)、改善通氣量 促進(jìn)產(chǎn)物合成 抑制雜菌 前體物質(zhì)和促進(jìn)劑 放線菌的分離 ? 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 次代培養(yǎng)及純化 ? 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異 ，作初步的鑒定和區(qū)分 。 ? 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài) 、 從而初步地加以鑒定 ， 在分離放線菌時顯得尤為重要 。 帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種 顯微觀察裝置 篩