【正文】 以及 代謝廢物的積累 抑制了生長。 （ 3）功能：產(chǎn)生 次生代謝產(chǎn)物 （抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了 連續(xù)培養(yǎng)技術 。 特點： 活的細胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降 、細胞裂解 或自溶。 絲狀微生物的群體生長 ：絲狀生長和沉淀生長兩種方式。 表示。 三、連續(xù)培養(yǎng) （一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) ： 分批培養(yǎng) ：指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng) 過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的培養(yǎng)方式。 連續(xù)培養(yǎng) ：在一個恒定容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物 (菌體和代謝產(chǎn)物 )，以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持穩(wěn)定。 環(huán)境因素對微生物生長的影響 一、溫度 溫度太低：使原生質(zhì)膜處于凝固狀態(tài)，不能正常進行 營養(yǎng)物質(zhì)的運輸或形成質(zhì)子梯度。 溫度太高：蛋白質(zhì)、核酸和細胞的其他組成發(fā)生不可 逆的變形作用。 最低生長溫度 三種基本溫度 最適生長溫度 最高生長溫度 根據(jù) 生長溫度 分類： 1. 嗜冷微生物 ：其所含 的 酶 在低溫能有效地催化生化反應；在低溫下主動運輸 仍能正常進行，有效的吸收必須的營養(yǎng)物質(zhì)，是其 原生 質(zhì)膜中含有較多的不飽和脂肪酸 ，在低溫下仍可維持膜 的 流動性 。 ：其酶和其他蛋白質(zhì)在高溫時更穩(wěn)定；其蛋白質(zhì)合成機構和細胞質(zhì)膜（富含飽和脂肪酸等）等結構成分是熱穩(wěn)定。 ： 發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)點是發(fā)酵周期短，效率高；有利于非 氣體物質(zhì)在發(fā)酵液中的擴散和溶解，以及防止雜菌的污 染；可節(jié)約冷卻發(fā)酵熱量所需的成本。 二、 pH ：介質(zhì) pH影響生活環(huán)境中 營養(yǎng)物質(zhì)的可給態(tài)和有毒物質(zhì)的毒性 ；影響 菌體細胞膜 的帶電荷性質(zhì)、膜的穩(wěn)定性及膜對物質(zhì)的吸收能力 ； 使 菌體表面蛋白變性或水解 。 ： 嗜 酸 性微生物（ ） 嗜 中 性微生物（ ～ ） 嗜堿性微生物（ ～ ） 原因 ： 主要是由于細胞本身具有 維持胞內(nèi) pH值接近中性 的能力。 嗜酸微生物在酸性環(huán)境中，細胞膜可以阻止 H＋ 進入胞內(nèi)、不斷將 胞內(nèi) H＋ 排出胞外。 而嗜堿或耐堿微生物，則可以阻止 OH進人胞內(nèi)并將其排出胞外，以維持胞內(nèi)接近中性 pH。 工業(yè)菌種的育種方針 ? 工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造 。 通過改造 ， 可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化 ， 或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀 。 工業(yè)菌種育種的方法 ? 誘變 ? 基因轉移 ? 基因重組 育種過程 ? 包括下列 3個步驟： ? (1)在不影響菌種活力的前提下 ， 有益基因型的引入 。 ? (2)希望基因型的選出 。 ? (3)改良菌種的評價 (包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 選擇育種方法時綜合考慮的因素 (1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關系 (如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗 )； (2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學萬面認識的明了程度； (3)經(jīng)濟費用 。 ? 如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少 ，則多半采用隨機誘變 、 篩選及選育等技術： ? 如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識 ， 則可選擇基因重組等手段進行定向育種 。 工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟 ，由此提供一個旁路代謝途徑 。 (2)增加前體物的濃度 。 (3)改變代謝途徑 ， 減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物 、 前體或產(chǎn)品的耐受力 。 (4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶 。 (5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 如誘導代謝產(chǎn)品的結構類似物抗性 。 提高特定基因的表達水平 ? (1)引入強轉錄及翻譯信號 ， 可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號 ， 提高基因效力等 。 ? (2)誘導解除基因表達抑制的突變 。 改進菌種的生長效率 ? 提高菌株對底物的利用率方法： ? a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分 。 ? b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn) 。 ? c. 賦予菌種對多種底物 ， 特別是價廉而豐富的底物的利用能力 ， 由此可降低操作費用 。 誘變育種 ? 以微生物的自然變異作為基礎的生產(chǎn)選種的機率并不很高 ， 一個基因的自然突變頻率僅 1061010左右 。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A的育種 ， 是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 誘變 物理、化學或生物誘變方法 一、誘變劑和誘變處理 ? 物理誘變劑：射線如紫外線 、 X— 射線 、 γ— 射線 ， 快中子； ? 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線 。 許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線 ，對于一般實驗室 、 中小型工廠都適用 ， 也很安全 。 ? 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的 ， 有一定的穿透力 ， 一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用 ，否則有一定危險性 。 化學誘變劑： 化學因子如堿基類似物 、 5— 氟尿嘧啶 、 烷化劑等 。 化學誘變劑中使用最多 、 最有效的是烷化劑 。 使用化學誘變劑的優(yōu)缺點： 大多數(shù)情況下 ， 就突變數(shù)量而言 ， 要比電離輻射更有效 。 化學誘變劑是很經(jīng)濟的 ， 因為只需要少量的合適的誘變劑 ， 設備是實驗室的一般玻璃器皿 ， 一個蒸氣罩 。 而用電離輻射工作時 ， 設備費用大 ， 并要注意安全性 。 大部分誘變劑是致癌劑 ， 所以在使用中必須非常謹慎 ， 要避免化學誘變劑與皮膚接觸 ， 且切勿吸入其蒸氣 ， 有人對某些誘變劑極其敏感 ， 甚至未直接接觸就會過敏 ， 這就更要當心 。 誘變劑的選擇 1． 堿基類似物和羥胺具有很高的特異性 ， 但很少使用 ，回復突變率高 ， 效果不大 。 2． 亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣 ， 造成的遺傳損傷較多 。 其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為 “ 超誘變劑 ” ， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一 。 3． 吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷 。 4． 紫外線十分有效 。 電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑 ， 它能造成不可回復的缺突變 。 但它可能影響鄰近基因的性能 。 二、誘變育種步驟 ?出發(fā)菌株的選擇 ?處理菌懸液的制備 ?誘變處理 ?中間培養(yǎng) ?分離和篩選 (一 )出發(fā)菌株的選擇 1． 自然界新分離的野生型菌株 ， 對誘變處理較敏感 ， 容易達到好的效果 。 2． 在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像 ， 也是良好的出發(fā)菌株 。 3． 每次誘變處理都有一定提高的菌株 ， 往往多次誘變能積累較多的提高 。 4． 出發(fā)菌株開始時可以同時選 2～ 3株 ， 在處理比較后 ， 將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變 。 5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 (二 )處理菌懸液的制備 ? 這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的 、活力類似的菌懸液 ， 為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng) ， 并要離心 ， 洗滌 ， 過濾 。 (三 )誘變處理 根據(jù)前面有關誘變劑及誘變處理的介紹 ， 結合誘變對象的實際 ， 設計誘變處理方案 。 (四 )中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前 ， 有一個表現(xiàn)延遲的過程 ， 即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程 (生理延遲 )， 需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來 。 這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的 。 方法： 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時 ，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復制 ， 讓細胞繁殖幾代 ， 以得到純的變異細胞 。 這樣 ， 隱性的變異就會顯現(xiàn)出來 ， 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) ， 直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能 ， 形成混雜菌落 ， 以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化 。 (五 )分離和篩選 ? 篩選分初篩和復篩 。 初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的 ， 以量為主 。 ? 復篩則是精選 ， 以質(zhì)為主 ， 也就是以精確度為主 。因此在具體方法上就有差異 . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者 ， 而將 90%的菌落淘汰 。 在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株 ， 最后才能選得優(yōu)秀菌株 。 在以后的復篩階段 ， 還應不斷結合自然分離 ， 純化菌株 。 紫外線的誘變育種 ? 紫外線誘變一般采用 15W紫外線殺菌燈 ， 燈與處理物的距離為 15～ 30cm， 照射時間依菌種而異 ，一般為幾秒至幾十分鐘 。 一般我們常以細胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 ? 被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為 106個／ ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為 106～ 107個／ ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。 ? 由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。 (二 )操作步驟 1． 將細菌培養(yǎng)液以 3000 r／ min離心 5 min， 傾去上清液 ， 將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌 。 2． 將菌懸液放入一巳滅菌的 ， 裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動 ， 以打散菌體 。 將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾 ， 單細胞濾液裝入試管內(nèi) ， 一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達 108個／ ml左右 ， 作為待處理菌懸液 。 3． 取 2～ 4 m1制備的菌液加到直徑 9 cm培養(yǎng)皿內(nèi) ， 放入一無菌磁力攪拌子 ， 然后置磁力攪拌器上 、 15W紫外線下 30cm處 。 在正式照射前 ， 應先開紫外線 10 min， 讓紫外燈預熱 ， 然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。 操作均應在紅燈下進行 ， 或用黑紙包住 ， 避免白熾光 。 4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 5．取照射菌液 2 ml于液體培養(yǎng)基中 (300 ml三角瓶內(nèi)裝 30 ml培養(yǎng)液 )， 120 r／ min振蕩培養(yǎng) 4～6 h。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7．挑取菌落進行篩選。 亞硝基胍誘變曲霉菌 ? N— 甲基 — N39。 硝基 N 亞 硝 基 胍 (NGN ，MNNG或 TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用 。 其精確的作用機制尚不很清楚 ， 據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在