【正文】 有活性。 一、質(zhì)粒 DNA的提取 Genomic DNA plasmid DNA The genomic DNA of E. coli: a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell. 閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快； （ 1） 原理 1 堿抽提法提取質(zhì)粒 DNA DNA雙鏈 變性 DNA單鏈 復(fù)性 強(qiáng)堿 中性 染色體線性 DNA或有缺口的質(zhì)粒 DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì) — SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。 σ因子 ,識(shí)別 DNA上的啟動(dòng)子 ,提高聚合酶與啟動(dòng)子的親和力 . 二、真核生物基因表達(dá) 第三節(jié) 操縱子學(xué)說(shuō) Jacob和 Monod對(duì)大腸桿菌乳糖發(fā)酵過(guò)程酶的適應(yīng)合成及一系列有關(guān)突變型進(jìn)行深入研究 ,于 1961年提出了乳糖操縱子模型 ,開(kāi)創(chuàng)了基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制研究的新領(lǐng)域 . 操縱子 :基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位 ,有共同的控制區(qū)和調(diào)節(jié)系 統(tǒng) .包括在功能上彼此有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和控制部位 . 乳糖操縱子 : 阻遏子 I 啟動(dòng)子 O 操縱子 P 結(jié)構(gòu)基因 Z Y A 乳糖操縱子基因表達(dá)調(diào)控模型 二、操縱子調(diào)節(jié)的類型 1 代謝產(chǎn)物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié) 正調(diào)節(jié) 負(fù)調(diào)節(jié) 2 降解產(chǎn)物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié) 3 環(huán)腺苷酸受體蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控 可誘導(dǎo) :乳糖操縱子 可阻遏 :色氨酸操縱子 B 基因工程的支撐技術(shù) ? DNA的提取與純化 ? 電泳技術(shù) ? 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)技術(shù) ? 核酸分子雜交 ? DNA序列分析 ? 基因定點(diǎn)突變技術(shù) ? 酵母雙雜交系統(tǒng) 第一節(jié) DNA的提取與純化 由于提取 DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同， DNA的提純有很多方法。如大腸桿菌 RNA聚合酶有四條多肽鏈，另有一個(gè)促進(jìn)新 RNA分子合成的 σ因子，因此它的組成的是 α2ββ’σ。 定義 : 一、原核生物基因表達(dá) 轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎同時(shí)發(fā)生 ,表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上 . RNA聚合酶（ RNA polymerase） 的作用是轉(zhuǎn)錄 RNA。帽子結(jié)構(gòu) 2) 具 ploy(A)尾 3) 單順?lè)醋? 第二節(jié) 基因表達(dá) 就是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程。第二章 基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)及基本技術(shù) ? 有關(guān)基因的基礎(chǔ)知識(shí) ? 基因工程的支撐技術(shù) A 有關(guān)基因的基礎(chǔ)知識(shí) ? 基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ? 基因表達(dá) ? 操縱子學(xué)說(shuō) 第一節(jié) 基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 基因 : 產(chǎn)生一條多肽鏈或功能 RNA所必需的全部核 苷酸序列 ,由 結(jié)構(gòu)基因 和 調(diào)節(jié)基因 組成 . 結(jié)構(gòu)基因 : 轉(zhuǎn)錄成各種 RNA直接行使功能 。轉(zhuǎn)錄成 mRNA,翻譯成功能蛋白質(zhì) . 調(diào)節(jié)基因 : 調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因 ,如啟動(dòng)子 , 增強(qiáng)子 ,終止子等 . 一、原核生物基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn) DNA 1) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練 2) 存在轉(zhuǎn)錄單元 3) 有重疊基因 mRNA 1) 半衰期短 2) 以多順?lè)醋有问酱嬖? 3) 存在 SD序列 二、真核生物基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn) DNA 1) 不連續(xù)性 2) 高度重復(fù)序列 衛(wèi)星 DNA mRNA 1) 5180。在一定 調(diào)節(jié)機(jī)制控制下，大多數(shù)基因經(jīng)歷基因激活、轉(zhuǎn)錄及翻譯等過(guò)程，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，但并非所有基因表達(dá)過(guò)程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)， 編碼tRNA、 rRNA基因轉(zhuǎn)錄合成 RNA的過(guò)程也屬于基因表達(dá)。原核生物 RNA聚合酶有比較復(fù)雜的亞基結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)稱為全酶（ holoenzyme） ,除去了 σ因子的酶稱為核心酶。其中最常用的是 堿抽提法 。 變性 （ 2） 所用的試劑作用 ① 溶菌酶 能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的?1， 4糖苷鍵。 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止 DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。 ④ NaOHSDS NaOH：強(qiáng)堿，提供 pH12的堿性條件，使 DNA 雙鏈變性。 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到 。 高濃度的 NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、 RNA等）沉淀。 ⑥ 乙醇 DNA分子以 水合狀態(tài) “溶于”水里，乙醇能奪去 DNA分子的水環(huán)境。 以免提取后的 DNA中含有小分子的 RNA。 由 TrisHCl和 EDTA配制。 蛋白變性劑 ，進(jìn)一步抽提 DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀 ,但苯酚會(huì)殘留在 DNA溶液中。 ⑨ 酚 氯仿 選用 以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。 第一步：溶菌 50mM葡萄糖， 25mM TrisHCl()， 10mM EDTA， 45mg/ml溶菌酶， RNase A 溶液 II 破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和 DNA變性。 Solution III的配制： NaOH， %SDS 3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào) pH至 ） 上清液中含有閉合質(zhì)粒 DNA。 第五步：純化 DNA 上清液 過(guò)柱 或酚 氯仿抽提。 一般要使用 endA基因 發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。 （ 1）受體菌株 endA基因編碼 核酸內(nèi)切酶 Ⅰ ， 在 Mg2+的存在下可將雙鏈 DNA消化成 7bp的寡核苷酸片斷。 （ 3）質(zhì)粒大小 分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少 。 二、基因組或其他 DNA的提取 1 細(xì)菌基因組 DNA的制備 （ 1）細(xì)胞裂解 10%SDS和蛋白酶 K。 不用 NaOH ! （ 2） DNA純化 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨 )除去 多糖 ，酚氯仿 異戊醇除去 蛋白 。 動(dòng)物組織剪成小塊，置 液氮 中凍結(jié)后 研磨 成細(xì)粉末。 （ 1）組織粉碎 2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組 DNA的抽提 （ 2）細(xì)胞裂解 %SDS和 。 SDS是離子型去垢劑（ detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。 （ 5）除去 RNA污染 用 RNase。 （ 4）沉淀 DNA （可以加入 1/10體積的 3M醋酸鈉 輔助沉淀） （ 1）組織粉碎 用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。 或 1% SDS和蛋白酶 K,65 oC溫育。 （ 3）純化 DNA 用苯酚和酚 氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。 （可以加入 1/10體積的 3M醋酸氨輔助沉淀） 。 用微量比色杯（ 10?l）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。 2 瓊脂糖凝膠電泳估計(jì) 原理： 與已知濃度的 DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出 DNA含量。 DNA分子量 Marker有許多公司的商品，使用非常方便。 四、 DNA分子量的估計(jì) Marker DNA ladder 28kb 2500bp 2300bp 1300bp 900bp 750bp 200bp 5000bp 20kb 1000bp 900bp 800bp 700bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp DNA Marker 1. 帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì) 相反的電極 移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。 3. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的 摩擦系數(shù) 成 反比 。 形狀相似的分子的遷移速度主要與 分子量 相關(guān) : 分子量越大，移動(dòng)越慢。 5. Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的 DNA: 閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開(kāi)環(huán)狀最慢。 是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。 濃度高 ,空隙小 瓊脂糖的濃度（ %） 分離 DNA的片斷大?。?bp） 50000— 1000 20220— 1000 6000— 300 空隙小，分辨率高： 小分子較易通過(guò)，而大分子難通過(guò)；