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浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定-展示頁

2025-01-25 05:50本頁面
  

【正文】 脂糖凝膠 。 見 圖 1 ( 一 ) 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 電泳時 , 由于分子形狀的不同 , 三種質(zhì)粒 DNA的泳動行為不同 , 根據(jù)電泳遷移率從小到大的順序分別為開環(huán)質(zhì)粒 DNA、 線狀質(zhì)粒 DNA和超螺旋質(zhì)粒 DNA。 ? ② 開環(huán)質(zhì)粒 DNA: ( ocDNA) 質(zhì)粒 DNA的兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 , 從而形成松弛的環(huán)狀分子 。 ( 一 ) 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 細(xì)菌 DNA與質(zhì)粒 DNA形狀上均為雙鏈環(huán)形 , 但二者的分子量相差較大 , 細(xì)菌 DNA的分子量在 109D左右 , 而質(zhì)粒 DNA的分子量僅為 106 ~107D, ? 提取純化質(zhì)粒的過程中 , 細(xì)菌 DNA大多斷裂成線狀分子 , 而質(zhì)粒 DNA則多數(shù)仍為雙鏈環(huán)狀 , 從而即可將二者分開 。質(zhì)粒 DNA的提取與酶切鑒定 (一)質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ?質(zhì)粒簡介 ? 質(zhì)粒是一種寄生性的自主復(fù)制子 , 存在于細(xì)菌等細(xì)胞中 , 為雙鏈閉環(huán)的 DNA分子 , 大小為 1kb~200kb之間 , 具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的能力 , 但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要利用宿主細(xì)胞 ( 細(xì)菌 ) 編碼的一些酶和蛋白質(zhì) 。 ?分離純化質(zhì)粒的原理 ? 分離純化質(zhì)粒 DNA主要是利用宿主細(xì)菌 DNA與質(zhì)粒DNA之間的差異來進(jìn)行的 。 ? 本試驗(yàn)采用微量堿變性法來分離純化質(zhì)粒 DNA,具體的分離純化原理如下: 0 細(xì)菌 (含質(zhì)粒) 溶菌酶 (震蕩) 破細(xì)胞壁 SDS NaOH ( 細(xì)菌 DNA和質(zhì)粒DNA均通過堿變性成為線狀分子 ) 破細(xì)胞膜 冰醋酸 細(xì)菌 DNA與變性蛋白和細(xì)胞碎片纏 繞在一起(不能復(fù)性) 質(zhì)粒 DNA經(jīng)復(fù)性后變?yōu)楣矁r閉合環(huán)狀 離心 沉淀:細(xì)菌 DNA、細(xì)胞碎片等 上清:質(zhì)粒 DNA、 RNA、可溶性蛋白等 酚:氯仿 離心 下層:酚,氯仿 中層:變性蛋白 上清(水層):質(zhì)粒 DNA、 RNA等 無水乙醇 離心 上清:可溶性雜質(zhì)等 沉淀:質(zhì)粒 DNA、 RNA等 RNase 質(zhì)粒 DNA ( 一 ) 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 質(zhì)粒 DNA的天然結(jié)構(gòu)為共價閉環(huán) ( 超螺旋 ) 結(jié)構(gòu) ,但在制備過程中 , 由于各種因素的影響 , 同一質(zhì)粒 DNA的分子可能呈現(xiàn)出如下幾種構(gòu)型: ? ① 超螺旋型 ( 共價閉環(huán) ) 質(zhì)粒 DNA: ( cccDNA)超螺旋狀 。 ? ③ 線狀質(zhì)粒 DNA: ( linearDNA) 質(zhì)粒 DNA的兩條鏈在同一處斷裂 , 從而變?yōu)榫€狀分子 。 ? DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定原理 ? 核酸是一種兩性電解質(zhì) ( 堿基 、 磷酸 ) , 在 , 核酸帶負(fù)電荷 , 電泳時向正極移動 ,根據(jù)核酸分子所帶電荷的多少 , 分子的大小及構(gòu)型的差異 , 可用電泳的方法對核酸進(jìn)行分離和鑒定 。 ? 不同濃度的瓊脂糖凝膠可以分離 200bp~50kb的DNA片斷 , 通過在瓊脂糖溶液中加入低濃度的瑩光染料溴乙錠 ( E
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