【正文】 CS、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；刃揎椃治? 魚類分子設(shè)計育種數(shù)量性狀多基因聚合技術(shù) 魚類分子設(shè)計育種的基因操作技術(shù) 多基因信息整合 性狀的 QTL 與 eQTL 分析 基因同線性與性狀關(guān)聯(lián)性分析 蛋白分子設(shè)計、 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除方法、 BAC 或Tol2 轉(zhuǎn)座子、 Cre/lox、 PGC 操作、miRNA和 piRNAs 調(diào)控 魚類生殖、生長和抗性 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析 魚類分子設(shè)計育種的策略和可行性途徑 （三）、創(chuàng)新點與特色： 1) 重要的研究對象，體現(xiàn)了國家重大需求導向： 本項目以我國重要養(yǎng)殖魚類鯽、鯉等為主要研究對象，圍繞水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新所要解決的魚類分子設(shè)計育種 的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計育種的 可行性途徑這兩個 關(guān)鍵科學問題開展研究，著眼于解決國家中長期發(fā)展中所需要解決的重大科學問題，體現(xiàn)了重大的國家需求導向。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗，輔以其它分子生物學方法如目的基因表達產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導處理等來分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測序等大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學分析，了解魚類生殖和生長不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達譜差異，經(jīng)生物信息學比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚類生殖、生長、抗性的主要基因和關(guān)鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應基因的啟動子；將其啟動子與 GFP 報告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細胞儀等篩選分析技術(shù)，進一步研究生物學功能； 3. 建立魚類 BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚，通過 EGFP 分析這些基因的時空表達情況及其生理學效應； 4. 通過基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎(chǔ)； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測基因表達的組織特異性和時序性 。 五年預期目標 : 1. 解析魚類生殖、 生長、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 篩選鑒定 具有自主知識產(chǎn)權(quán)、 可用于魚類分子設(shè)計育種的功能基因和分子標記 30－ 50 個 ； 3. 揭示魚類性別決定與分化、卵母細胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機制； 4. 闡明魚類生長激素分泌的信號通路； 5. 闡明魚類 干擾素系統(tǒng)關(guān)鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機理；闡明魚類抗寒關(guān)鍵信號通路及其作用機理； 6. 建立魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設(shè)計和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟性狀功能基因組研究和分子設(shè)計育種中間的有機聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個在生殖、生長 或抗性等目 標經(jīng)濟性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國際影響的中青年學術(shù)帶頭人 和學術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學術(shù)論文，其中在有重要國際影響的期刊（ 相關(guān)領(lǐng)域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 二、預期目標 本項目的總體目標： 針對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求，通過開展重要養(yǎng)殖魚類生殖、生長和抗性等主要經(jīng)濟性狀的功能基因組研究，解析魚類生殖的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚類抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選鑒定進行分子設(shè)計育種的主控或關(guān)鍵基因和分子標記，建立魚類分子設(shè)計育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，在理論上闡明魚類生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀和重要生命現(xiàn)象的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理，提出魚類良種分子設(shè)計的策略；在技術(shù)方法上，建立魚類分子設(shè)計育種的多基因聚合和基因操作技術(shù)，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)育種材料，創(chuàng)建魚類分子設(shè)計育種的可行性途徑。 4）魚類分子設(shè)計育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚類經(jīng)濟性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們在群體和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟性狀主效基因標記和基因不同組合的遺傳效應，評估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 3） 魚類抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細胞模型，重點解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；探討在魚類抗病免疫反應中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能和抗病機理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè)計育種的理論和技術(shù)方法，開拓其可行性途徑。 項目名稱： 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 首席科學家： 桂建芳 中國科學院水生生物研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國科學院 湖北省科技廳 一、研究內(nèi)容 基于擬解決的魚類分子設(shè)計育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計育種的 可行性途徑這 兩個 關(guān)鍵科學問題， 本項目擬集中在魚類主要經(jīng)濟性狀如生殖、生長、抗性 的功能基因組和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)方面， 重點解析這些主要經(jīng)濟性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開拓關(guān)鍵技術(shù)，其主要研究內(nèi)容包括： 1） 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 及其分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 采用基因轉(zhuǎn)移、 morpholino 介導的基因敲降等技術(shù)，配合整體原位雜交、細胞示蹤和免疫熒光定位等方法，重點解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示重要生殖調(diào)控基因在魚類卵母細胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換中的功能作用及其調(diào)控機制；探討魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及其及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；通過大規(guī)模 RFLP 分析等呈現(xiàn)技術(shù)，篩選雌雄個體間性別特異的 DNA 片段標記，進而通過 Genomic Walking 克隆分離與性別決定和性別分化相關(guān)基因；揭示魚類性別決定和性別 分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計育種的性別特異表達基因和分子標記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標記用于魚類分子設(shè)計育種的可行性途徑。 2） 魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導的基因敲降、整體原位雜交、細胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點解析魚類下丘腦/垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機理；探討腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調(diào)控機制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚類肌肉細胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化規(guī)律；開拓生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標記尤其是主控基因用于魚類分子設(shè)計育種的可行性途徑。 采用大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達譜與耐寒魚類基因表達譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計育種的可行性途徑。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚類分子設(shè)計育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長激素受體基因與轉(zhuǎn)生長激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應及其信號通路的調(diào)控差異。通過這些研究，使我國在魚類功能基因組研究中居國際領(lǐng)先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻。 三、研究方案 （一）、學術(shù)思路： 針對 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求， 以鯽和鯉等為主要研究對象，啟動我國 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究， 通過研究魚類生殖、生長和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理，篩選鑒定進行分子設(shè)計育種的關(guān)鍵基因和分子標記，建立魚類分子設(shè)計育種的關(guān)鍵技術(shù) 及其技術(shù)體系，解決魚類分子設(shè)計育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計育種的 可行性途徑這兩個 關(guān)鍵科學問題，為魚類分子設(shè)計育種的實踐和應用以及為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細胞和亞細胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對一些重要蛋白進行質(zhì)譜分析、并對其進行泛素化、乙?；土姿峄刃揎椃治?； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動子 CpG 島甲基化差異和基因表達調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。將含有這些基因的真核表達載體，或在大腸桿菌中表達出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細胞中，觀察生物學效應； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學效應； 12. 對生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實驗，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實驗組和對照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達的時序性； 13. 對生長和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測定等方法研究其活性，測定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長激素的含量，分析這些生長調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號傳遞機制，分析它們對魚類生殖和生長的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實驗室日常工作的、簡潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺；通過克隆獲得的魚類來源的啟動子構(gòu)建針對草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導的系統(tǒng)進行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細胞和生殖干細胞系，建立魚類培養(yǎng)細胞體外基因操作和個體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號通路和作用機理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細胞模型，研究病毒與宿主細胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟性狀相關(guān)的分子遺傳標記，進而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標記進行基因型分析的優(yōu)勢，研究特定標記與某些經(jīng)濟性狀（例如生長、性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進行分子標 記輔助育種；開展魚類生長、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點，以簡化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對 DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗鋅指氨基酸序列，設(shè)計靶標多肽和堿基序列；將靶標多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測顯微注射個體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個體擴大培養(yǎng)，并進行相互交配，以獲得基因的兩個拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 2) 獨特的研究體系，注重發(fā)揮中國特色和優(yōu)勢： 銀鯽多倍體的遺傳背景和同時具有的雌核發(fā)育生殖和有性生殖雙重生殖方式以及性逆轉(zhuǎn)魚類奇特的性別分化現(xiàn)象為解析魚類生殖和性控的基