【正文】 基因，正對這些候選基因進行共分離分析和功能互補分析，有望獲得突破。目前，我們又利用日本晴和 IRBB3 組合構建了約 5000 單株的 F2 群體， 對 Xa3 基因作進一步精細定位。目前功能互補實驗已獲得轉基因植株。將 xa5 限定在 12kb 的片段上，在此區(qū)間發(fā)現(xiàn)唯一一 個候 選基因，與已知抗病基因具有不同的結構。 1定位克隆了隱性抗白葉枯病基因 xa5 的候選基因 本研究利用 RFLP、 CAPS 等標記方法對 xa5 近等基因系 IR24 和 IRBB5 構建的 F2 群體共 5000 個單株進行群體連鎖分析，構建了 xa5 的精細遺傳圖譜。 NL 基因進行 RTPCR 和 cDNA 對 庫篩選分析， 發(fā)現(xiàn) NLB 能夠在含抗白葉枯病基因 Xa4 水稻品系 IRBB4 中特異表達， 說明 NLB 參與了白葉枯病抗性反應。 同時 ,對近等基因系 IRBB56 同一基因組位臵的 BAC 克隆 106P13 進行分析，發(fā)現(xiàn)其 上有 10 個 NL 同源拷貝，其中有 4 個同 14E19 上的 NL 一樣，說明 NL 是一個至少 有 10 個成員（分別命名為 NLA— NLJ）的基因家族。利用克隆的抗病同源序列 RS13 作為探針，從水稻 IR64 的 BAC 文庫中篩選到 4 個陽性克隆，其中一個克隆 14E19 能夠覆蓋其余 3 個克隆。本研究中建立的提取高質量水稻基因組 DNA 方法和高效轉化方法被成功地用于中國超級雜交稻測序 (Science, 2020,296: 7992)。用 分布于水稻 3 條不同染色體、分別與 Xa xa5 和 xa13 連鎖的 DNA 標記篩選文庫， 分別檢測出 11106 個陽性克隆，為克隆這些基因打下了基礎。 按水稻基因組為 450 Mb 計，該文庫覆蓋 14 倍基因組，篩選出任一水稻基因或序 列的概率為 ％。 9．構建了含 Xa xa5 和 xa13 三個抗性基因的 IRBB56 基因組 BAC 文庫 利用含 Xa xa5 和 xa13 三個水稻白葉枯病抗性基因的累加系 IRBB56 構建了 一個水稻細菌人工染色體文庫。這些 RS 標記可以作為圖位 克隆同一位點上相應抗病基因的起點。將這些 RS 序列在窄葉青 /京系 17 的重組自交系（ RIL）構建 的分子圖譜上定位，定位結果表明它們分布在 1， 3， 4， 7， 8， 9， 10 和 11 染色 體。涉及這部分工作的論文已經發(fā)表（張利達等， 2020,遺傳學報 30:147153） 。 這一聚類策略能降低測序錯誤帶來的影響，有效識別基因家族成員，并避免選擇 性剪接的干擾。 7. 發(fā)展了一種新的 EST 聚類方法 我們發(fā)展了一種新的計算機分析方法，用于分析大規(guī)模 EST 測序中所產生的 大量數(shù)據(jù)，以獲得高質量、非重復表達序列。對該文庫中的 大約 4 萬個 cDNA 克隆進行了測序， 獲得兩萬多個非重復 EST 序列。該文庫由水稻不同 生長時期和不同生理狀態(tài)下的 15 種不同組織的 cDNA 組成，包括白葉枯病菌和稻 瘟病菌接種誘導后的組織。 涉及 Xa25(t)基因的研究工作已發(fā)表 （ Chen et al., 2020, Phytopathology 92:750754） 。通過分析攜 帶 Xa25(t)基因的重組自交系群體，將該基因定位于水稻第 12 號染色體的著絲粒 區(qū)。 15. 鑒定并精細定位了一個水稻抗白葉枯病新基因 Xa25(t) 在雜交水稻恢復系明恢 63 中鑒定了一個新的抗白葉枯病顯性基因 Xa25(t)。我們對 水稻品種明恢 63 和特青包含 Xa26 基因家族的大約 100 kb 區(qū)段進行了測序，對比公共數(shù)據(jù)庫中的水稻品種日本晴和 9311 的同源區(qū)段的序列，分析了抗病基因的 進化模式。目前，這部分工作正在完善 之中。 抗性分析發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)秈稻品種特青和 9311 與 IRBB4 的抗譜相同，序列分析發(fā)現(xiàn)特青和 9311 也攜帶 Xa4 基因。序列分析發(fā)現(xiàn)這該基因也編碼 LRR 受體激酶類蛋白質。因為 Xa3 和 Xa22(t)基因也被他人定位于第 11 號染色體長臂末端，推 測 Xa2 Xa3 和 Xa22(t)是同一個基因，這部分驗證工作正在進行之中。 分離克隆 Xa26 基因的工作正在發(fā)表印刷之中 （ Sun et al., 2020, Plant J., in press） 。序列分析發(fā)現(xiàn)這該基因編碼 LRR 受體激酶類蛋白質。涉 及 Xa4 基因（ Sun et al., 2020, Theor. Appl. Ge. 106:683687）和 Xa26 基因（ Yang et al., 2020, Theor. Appl. Ge. 106:14671472）遺傳分析的 工作已發(fā)表。 具體工作與取得的進展如下 : 1. 精細定位了水稻抗白葉枯病基因 Xa4 和 Xa26 我們利用 F2 大群體，分別對水稻抗白葉枯病基因 Xa4 和 Xa26 進行了遺傳分 析和精細遺傳定位。目前已克隆并證實了 Xa26 基因；已克隆 Xa4 和 xa5 基因，即將證實其功能；精細定位了 Xa xa13 和 Xa25(t)基因；獲得了 3 個抗稻瘟病相關基因。973 項目結題總結報 告 篇一： 973 課題的結題總結報告 農業(yè) 國家重點基礎發(fā)展規(guī)劃項目課題結題總結報告項 目 編 號： G1998010200 項 目 名 稱：農作物資源核心種質構建、重要新基因發(fā)掘與有效利用研究 首 席 科 學 家：賈繼增 張啟發(fā) 課 題 編 號： G1998010207 課 題 名 稱：水稻抗病基因克隆 課 題 負 責 人：翟文學 子 課 題 負 責 人：翟文學 彭開蔓（王石平）承 擔 單 位：中國科學院遺傳所，華中農業(yè)大學 電 子 信 箱：, 年 9 月 30 日一、計劃任務完成情況本課題的預期目標是分離克隆 2 個水稻抗病基因。我們已經按計劃開展了研 究工作，分別對水稻抗白葉枯病基因 Xa Xa xaxa1 Xa25(t)和 Xa26 以及 抗稻瘟病相關基因進行了克隆研究。基本達到預期研究目標。這兩個基因都位于第 11 號染色體的長臂末端并緊密連鎖。 2. 分離克隆了水稻抗白葉枯病基因 Xa26 我們采用圖位克隆法從水稻品 種明恢 63 中分離克隆了 Xa26 基因（專利申請 號： ） 。研究還發(fā) 現(xiàn)，無論是在苗期還是成株期攜帶 Xa26 基因的轉基因水稻的抗譜比 Xa26 基因的 供體水稻品種（明恢 63）的抗譜顯著增寬，抗性明顯增強，說明遺傳背景可能影 響抗病主效基因的作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)攜帶抗白葉枯病基因 Xa3 的近等 基因系 IRBB3 和攜帶抗白葉枯病基因 Xa22(t) 的云南地方稻品種扎昌龍也攜帶 Xa26 基因。 3. 分離克隆了水稻抗白葉枯病基因 Xa4 我們采用圖位克隆法從水稻近等基因系 IRBB4 中分離克隆了 Xa4 基因（專利 申請?zhí)枺?） 。 Xa4 和 Xa26 屬于同一個 基因家族的不同成員。轉基因初步 實驗結果顯示遺傳背景可能也影響 Xa4 基因的抗性。 4. 分析了 Xa4 和 Xa26 所屬基因家族的進化 Xa4 和 Xa26 基因所屬家族（命名： Xa26 基因家族）包括 10 個成員。涉及這部分工作的論文正在撰寫之中。 該基因在苗期和成株期都能特異性的抗白葉枯病菌生理小種 PXO339。在該著絲粒區(qū)段已經定位了多個水稻抗稻瘟病基因，推測 Xa25(t)基因與抗稻 瘟病基因緊密連鎖或等 位。 6. 構建了水稻全生育期平衡化 cDNA 文庫 利用水稻品種明恢 63，構建了全生育期平衡化 cDNA 文庫。 該文庫包含大約 62,000 個克隆， 平均插入片段為 kb （ Chu et al., 2020, Chinese Science Bulletin 48:229235） 。利用該文庫 我們建立了高效 cDNA 芯片（包括 cDNA array 和 cDNA microarray）分析體系。該方法在聚類過程中采用 MEGABLAST 工具對一致序列進行序列同源比較，并用 phrap 程序對每一 EST 簇進行拼接檢驗。與 NCBI（ National Center for Biotechnology Information）的 UniGene clustering 方法相比， ESTClustering 的聚類結果可以更好地反映表達 序列的多樣性。 8. 克隆獲得了一批水稻抗性基因同源序列 利用植物 NBS－ LRR 類抗性基因的高度保守區(qū)設計 PCR 引物從水稻基因組中擴 增同源序列，經克隆測序確定后獲得了 23 個不同的 NBS 片段（稱為抗性基因同源 序列，簡記為 RS） 。其中 10 個 RS 位于已知 R 基因所在的染色體區(qū)間。 有關結果已發(fā)表 （ Zheng et al， 2020,CIENCE IN CHINA (Series C), 44(3): 253262） 。 該文庫包含 55296 個克隆， 平均插入片段為 132 kb。 用均勻分布的 3 個葉綠體 基因和 4 個線粒體基因克隆作探針 2篩選文庫，結果顯示該文庫中含細胞器基因組 DNA 同源序列的克隆數(shù)小于 1％。該文庫對水稻基 因組的高度覆蓋率和較大的插入片段，非常適合于物理作圖和基因的分離和克隆 （王文明等， 2020，遺傳學報 , 28(2)： 120－ 128； Wang et al., 2020, Molecular Geics and Genomics, 265: 118125） 。 克隆了一個 NBSLRR 類抗性基因家族 用水稻抗白葉枯病基因 Xa4 的近等基因系和基因累加系對克隆的 NBSLRR 同 源序列 RS13 進行 RFLP 分析， 發(fā)現(xiàn)序列 RS13 來自 Xa4 基因位點 （ Wang et al, 2020, Chinese Science Bulletin, 45(19): 17791782） 。對 14E19 進行了全序列測定和分析，獲得了 73kb 的全長 DNA 序列，基因預測顯示其上有 4 個編碼 NBSLRR 的基因，分別命名為 NLA－ D。搜索日本晴、 931廣陸 矮 4 號的序列， 發(fā)現(xiàn)三者也有多個高度同源的序列。 把這些同源拷貝作為新的抗病基因進行研究， 轉基因實驗正在證實這些同源拷貝的功能。在此基礎 上我們用 與 xa5 基因緊密連鎖的標記篩查含有 xa5 的水稻累加系 IRBB56 的 BAC 文庫，構建了包含 xa5 基因位點的精細物理圖譜（ Zhong et al, Chinese Science Bulletin, in press） 。該基因與顯性等位基因編碼的氨基酸 序列有差異。 12．開展了抗白葉枯病基因 Xa3 和 xa13 的精細定位與圖位克隆 本研究利用 IR24 與含 Xa3 基因的近等基因系 IRBB3 組合構建了約 2020 單株 的 F2 定位群體，并利用國際水稻基因組和中國超級雜交稻基因組計劃所公布的第 11 染色體長臂上的序列設計出一系列 SSLP 和 CAPS 標記，對 Xa3 進行精細定位， 將 Xa3 基因定位于 CAPS 標記 Y3 和 SSR 標記 RM144 之間， Y3 約 ， RM144 距 距 約 。 3利用 xa13 的近等基因系構建了包含 4000 單株的 F2 群體，將 xa13 基因界定 在第 8 染色體 80Kb 的區(qū)間。 1分離克隆了抗稻瘟病相關基因 本研究利用 cDNAAFLP 和組池分離分析(BSA)相結合的方法來檢測稻瘟病抗池 和感池中特異表達的基因。利用水稻的 DH 群體對它們 進行遺傳定位結果表明其中的 5 個 DEBs， R1, R8, S9, S16 和 S17 被定位在第一 染色體的一個抗稻瘟病的 QTL 所在的區(qū)間。逆向 Northern Blotting 和定量 RTPCR 分析表明 R1(S16)， S17 和 R8(S9)在接種稻瘟病菌后的表達水平都是上調的，這暗示它們都參與了稻瘟病抗性反應過程。二、研究水平與創(chuàng)新性本研究是在基因的水平上發(fā)掘水稻的抗病種質， 重點是克隆符合 “ 基因 對基因 ” 假說的，以過敏性抗病反應為基礎的水稻抗病基因。它們分屬于 二種不同的結構類型。 本研究特色在于應用水稻基因組研究的遺傳作圖和物理作圖的綜合技術以及 在基因組測序基礎上發(fā)展起來的基因 預測方法，充分利用水稻基因組較小的特征， 從多種途徑發(fā)現(xiàn)抗病和感病的水稻材料的遺傳差異，克隆水稻的抗病基因。 雖然近年來抗病基因研究取得許多突破，但是我們也發(fā)現(xiàn)已克隆的植物抗病 基因多為顯性基因，隱性抗病基因的研究進展不大。為此我們在本課題后期啟動了水稻隱性抗病基因 xa5