【正文】 形成等是貝類 重要或特有的經(jīng)濟(jì)性狀，以功能基因組學(xué)為基礎(chǔ)，篩選上述性狀的關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，闡明基因?qū)π誀畹臎Q定機(jī)制，解析主要性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)。通過對(duì)牡蠣基因組結(jié)構(gòu)與特征的全面解析，結(jié)合其與扇貝、珍珠貝基因組的比較研究，進(jìn)行貝類全基因組基因功能 研究 ；批量開發(fā)基于基因組信息的功能基因和 SNP 等標(biāo)記；構(gòu)建高密度遺傳圖譜，為貝類生長(zhǎng)、發(fā)育、抗性、珍珠形成等性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析和分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)。 項(xiàng)目名稱： 養(yǎng)殖貝類重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析與設(shè)計(jì)育種基礎(chǔ)研究 首席科學(xué)家： 張國(guó)范 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國(guó)科學(xué)院 山東省科技廳 一、研究?jī)?nèi)容 （一）擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 從基因組學(xué)出發(fā)，明確貝類基因組結(jié)構(gòu)與特征，闡明重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，建立貝類分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，是貝類分子育種領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問題，也是實(shí)現(xiàn)貝類高效 “精確育種 ”的必要前提。 1. 重點(diǎn)闡明 23 個(gè)重要功能基因在殖質(zhì)的形成和遷移、卵子成熟、卵胚轉(zhuǎn)換和性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 獲得 35 個(gè)重要的通過調(diào)控生長(zhǎng)軸因子和育性調(diào)控的轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖或模式魚品系，用以開展個(gè)體促生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀改良的研究平臺(tái)； 3. 闡明 23 個(gè)重要基因在病毒感染識(shí)別以及抗病毒信號(hào)傳遞中的作用機(jī)理；闡明 23 個(gè)重要基因在細(xì)菌感染識(shí)別等信號(hào)傳遞中的作用機(jī)理； 5. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長(zhǎng) 或抗性等目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 路線和策略； 7. 建立優(yōu)化和完善的基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)； 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 8. 穩(wěn)定遺傳、快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚家系的建立 ，創(chuàng)制原生殖細(xì)胞操作技術(shù)和可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚模型 ， 闡明小RNA 分子在性分化過程的分子調(diào)控機(jī)理。 子代親本 2020 尾以上；分析鯉魚 QTL或主效基因的聚合效應(yīng)、育種效率與潛力； 8. 獲得可用于原生殖細(xì)胞操作的、的基因操作載體 ， 獲得具有表型效應(yīng)的基因敲除的純合子個(gè)體； 9. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚 F2 代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞發(fā)育被影響的轉(zhuǎn)基因胚胎 ， 揭示小 RNA 及其互作蛋白和靶基因的相互作用。 、生長(zhǎng)、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 1015個(gè)； 23個(gè)重要基因在生殖質(zhì)的形成和遷移、卵母細(xì)胞成熟、卵胚轉(zhuǎn)換以及性別決定和分化中的功能；確定基因啟動(dòng)子的差異甲基化修飾在其表達(dá)和生殖調(diào)控中的作用； 3. 分析魚類生長(zhǎng)軸負(fù)反饋調(diào)控受阻對(duì)魚體肌肉組織的生長(zhǎng)和肉質(zhì)特征的影響；揭示可控性卵巢組織發(fā)育抑制的轉(zhuǎn)基因魚品系操作特性以及其抑制效率，觀察性成熟受阻對(duì)魚體生長(zhǎng)發(fā)育影響特征； 4. 構(gòu)建所選擇魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并對(duì)其起源提出假設(shè)； 5. 闡明 23 個(gè)關(guān)鍵抗病毒相關(guān)基因的抗病毒作用及其功能機(jī)理；闡明抗菌肽基因的抗細(xì)菌功能及其功能機(jī)理；鑒定魚類具有重要育種價(jià)值的與抗病性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記或功能標(biāo)記 23 個(gè)； 6. 建立育種上有價(jià)值的抗 細(xì)菌病的牙鲆等魚類雌核發(fā)育系和近交家系 5個(gè)左右； 7. 揭示 4 個(gè)重要抗寒基因的生物學(xué)功能 ； 鑒定 4－ 5 個(gè)有可能用于育種的抗寒基因 ； 獲得具有抗寒性能的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型 ； 8. MAPPING 到圖譜上 300 個(gè)標(biāo)記以上；建立后備親魚成熟的核心群體年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 100 尾以上；驗(yàn)證鯉魚和銀鯽 10 個(gè)左右基因與生長(zhǎng)、抗病（抗寒）或飼料轉(zhuǎn)化率等性狀的關(guān)聯(lián)性，驗(yàn)證 46 個(gè)QTL 或主效基因的遺傳效應(yīng)和育種潛力； 9. 建立穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和Cre/lox 基因靶位操作模型 ， 獲得EAF1 等 基因敲除斑馬魚的雜合子個(gè)體； 10. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活 的生長(zhǎng)激素受體基因魚 F1 代 ， 完成原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的分子設(shè)計(jì) ， 揭示小 RNA作用的靶基因。 7. MAPPING 到圖譜上 300個(gè)標(biāo)記以上；建立后備親魚的核心群體 100尾以上；圖譜定位 QTL1020個(gè)，獲得基因同線性分析的結(jié)果； 8. 獲得可用于魚類轉(zhuǎn) 基因的高效的轉(zhuǎn)座子 和 Cre/lox基因靶位操作體系 ， 獲得 EAF1等基因敲除的斑馬魚胚胎； 9. 獲得轉(zhuǎn)基因魚 P0代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因敲落 的胚胎和 原生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子系統(tǒng) ， 揭示小RNA動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，獲得相關(guān)互作蛋白。 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫(kù)以及與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組 的進(jìn)一步 分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 差異順式調(diào)控序列與相關(guān)基因啟動(dòng)子差異甲基化修飾的關(guān)系分析； 4. 可控性卵巢發(fā)育抑制轉(zhuǎn)基因魚類模式品系的構(gòu)建； 5. 抑肌素信號(hào)通路研究； 6. 牙鲆抗病性狀關(guān) 聯(lián)分析基礎(chǔ)群體和 QTL 作圖群體構(gòu)建； 7. 抗 寒基因轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究 及 子一代 的 耐寒性能評(píng)估 ； 8. 遺傳圖譜構(gòu)建及其鯉魚 QTL 或主效基因在染色體上的同線性分析； 9. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率比較， Cre/lox 基因靶位操作效率分析 ， 基因敲除試驗(yàn) 和表型觀察 ； 10. 轉(zhuǎn)持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因 魚 P0 代的建立 ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的表達(dá)敲落 和啟動(dòng)子分析，小 RNA 動(dòng)態(tài)變化規(guī)律 和 互作蛋白的研究。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計(jì)劃 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫(kù)構(gòu)建以及與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號(hào)表達(dá)水平改變對(duì)魚體肌肉生長(zhǎng)的調(diào)控研 究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚 QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗(yàn)證； 7. 魚類生長(zhǎng)和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的分子設(shè)計(jì) ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測(cè)序。 承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 課題負(fù) 責(zé)人 ： 童金茍 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 孫效文 、王忠衛(wèi)、俞小牧、張驍鋒、耿波、賈智英、梁利群 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 6 基于魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)研究 主要研究目標(biāo)： 創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)；優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)；揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的新途徑，闡明 piRNA 與互作蛋白及其調(diào)控途徑；創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系；研制出持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的轉(zhuǎn) 基因魚；揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長(zhǎng)激素受體基因與轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應(yīng)及其信號(hào)通路的調(diào)控差異。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所、中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 陳良標(biāo) 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 沈玉、曹立雪、譚訓(xùn)剛、尤鋒 經(jīng)費(fèi)比例： 10% 課題 5 魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)研究 主要研究目標(biāo)： 建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)；揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系；闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及在群體 和家系中的功能；確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率；創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合育種的技術(shù)路線。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 廖小林 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 陳松林 張義 兵 、 朱蓉、袁秀平、沙珍霞 、 田永勝、王娜 、 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 4 魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；闡明魚類耐寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類下丘腦 /垂體的功能基因組以及魚類生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理研究； 腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路和對(duì)魚類生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究； 抑肌素信號(hào)調(diào)控在魚類肌肉細(xì)胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用機(jī)理研究； 可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系研制及其生理學(xué)功能分析； 魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律研究； 生長(zhǎng)調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑研究。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚類生殖質(zhì) 的 成分解析及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類生殖質(zhì)主要成分的功能及其作用機(jī)制研究； 魚類配子發(fā)生過程中特異性甲基化等位基因功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類卵母細(xì)胞特異組蛋白、 Spindlin 在卵子成熟中的作用及調(diào)控機(jī)制研究； 魚類卵 胚轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制研究； 魚類性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能解析和作用機(jī)理研究； 魚類性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記的鑒定及其分子設(shè)計(jì)育種可行性研究。 以下將具體說明各課題的主要研究目標(biāo)、主要研究?jī)?nèi)容、承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé) 人及主要學(xué)術(shù)骨干和經(jīng)費(fèi)比例等。項(xiàng)目的主要研究?jī)?nèi)容、課題設(shè)置的思路、各課題間的聯(lián)系和與項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和總體目標(biāo)的關(guān)系如下圖所示。 3) 堅(jiān)實(shí)、完善的研究基地，支撐有力： 本項(xiàng)目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、有害生物控制和資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)部門重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室研究基地的研究條件，這些實(shí)驗(yàn)室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí)支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容是在這些基礎(chǔ)上進(jìn)一步凝聚而來，目標(biāo)更為明確。 3) 新 穎 的學(xué)術(shù)思路， 起到前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用 ： 本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)了國(guó)際上有關(guān)魚類分子設(shè)計(jì)育種的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題，試圖直接通過解析魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來闡明其調(diào)控機(jī)理，篩選鑒定可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，由此創(chuàng)建魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，對(duì) 指導(dǎo)并推動(dòng)我國(guó)水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測(cè)定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動(dòng)子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚類（斑馬魚、青 鳉 、河豚、三棘刺魚 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚類細(xì)胞系 魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的主控基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時(shí)空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法 ChIP、 EMSA 等研究核酸與蛋白相互作用等方法 FA