【正文】 （ 2） 分析鑒定 一批與 貝類生長發(fā)育 、抗性性狀 、 貝類珍珠質形成相關 基因，獲得 SNP 分子標記 、初步了解相關基因表達和調控模式 。 （ 4） 完成論文數(shù) 3542 篇，其中 SCI收錄 3541 篇，申請專利 57 項 第 二 年 （ 1）貝類基因組特征解析、基因功能注釋與分類，開展轉錄組和表達譜研究； 作圖家系的傳代培育；開發(fā)SNP 和微衛(wèi)星標記；開展部分標記的家系分析。 （ 3） 開展 扇貝和牡蠣核心種質、骨干親本的性狀測量、 SNP 分型和養(yǎng)殖條件參數(shù)監(jiān)測 。 3） 模擬與驗證： 實現(xiàn)模擬育種與實際分子育種的相互促進和驗證，建立貝類分子設計育種技術平臺。 經(jīng)費比例： % 承擔單位： 清華大學、海南大學 課題負責人： 謝莉萍 學術骨干： 顧志峰、李鵬、李玉明、 痲 彩萍、石耀華、王愛民、王嫣、張貴 友 課題 貝類分子設計育種的關鍵技術研究 預期目標： 1）主要性狀 GP模型 ：構建 23個主要育種性狀的 GP 模型和相應數(shù)據(jù)庫； 2）育種模擬技術平臺 ：完成育種模擬技術平臺構建，能夠對實際育種過程的親本選配和后代選擇提供參考，輔助應用于 12個新品種培育，檢測分子設計育種的策略和可行性。 研究內容： 1）珍珠質形成相關功能基因的篩選與鑒定 ： 選取生長和珍珠質量差異顯著的珍珠囊或不同珍珠貝家系的外套膜組織，通過表達譜等技術篩選高差異表達基因的 EST，并與珍珠貝全基因組序列進行同源 性比對，篩選珍珠質礦化相關的功能基因。 2）抗逆相關功能基因與表型相關關系、作用機制和調控機理 ：篩選、克隆與耐鹽、耐溫相關的功能基因，分析研究其表達特征和作用機理；通過全基因組序列確定耐鹽、耐溫相關基因；研究候選基因多態(tài)性，篩查 SNP 等分子標記；利用特定耐鹽、耐溫的貝類材料，采用連鎖分析、關聯(lián)分析、轉錄 組、蛋白組等技術方法，開展 QTL 定位，確定耐鹽、耐溫候選功能基因或關鍵基因與耐性表型相互關系，進行功能驗證，解析、闡明關鍵基因在耐性相關過程的調控規(guī)律和網(wǎng)絡途徑，分析它們在抗性分子設計育種中的應用途徑。 3）生長發(fā)育基因調控網(wǎng)絡 ：利用貝類特定耐性材料，研究生長相關基因與環(huán)境的互作；采用 RNAi、噬菌體展示和酵母雙雜交等技術，研究貝類發(fā)育尤其是幼蟲變態(tài)和原生殼形成相關功能基因的轉錄調控機制及信號轉導通路， 闡明其表達調控網(wǎng)絡。 2）功能基因 鑒定 ： 明確 1520 個 關鍵基因 在貝類 生長發(fā)育 中的作用 ，提出2 個生長和變態(tài)基因調控模型；篩查 35 個功能 SNP 多態(tài)分子標記，明確其對性狀的遺傳效應，建立基因型與表型的關系。 經(jīng)費比例： 21% 承擔單位： 中國科學院海洋研究所、深圳華大基因研究院 課題負責人： 張國范 學術骨干： 鄭洪坤、張素萍、張海濱、王曉通、許飛、蔣智、吳震州 課題 貝類 SNP 規(guī)模發(fā)掘與高密度遺傳圖譜的構建 預期目標： 1） SNP 標記開發(fā) ：開發(fā)貝類 6000 個以上 SNP 標記； 2） 遺傳圖譜構建 ：構建牡蠣 等 高密度遺傳圖譜，標記間距離小于 1cM； 3） 知識產權與人才培養(yǎng) ：發(fā)表 SCI 論文 30 篇 ，其中影響因子 ? 論文 2 篇，專利 35 項， 培養(yǎng)博士研究生 15 名，碩士研究生 8 名，博士后 2 名。 4）知識產權與人才培養(yǎng) ：發(fā)表 SCI 論文 30 篇，其中影響因子 ? 論文 2篇，頂級刊物 發(fā)表研究論文 1 篇，專利 8 個，培養(yǎng)碩士研究生 15 名、博士研究生 10 名和博士后 3 名。六個課題的設置以及與科學問題的對應關系見圖 2。圍繞生長發(fā)育， 抗性和珍珠質形成 等重要經(jīng)濟性狀的分子解析，設置了 3 個課題，以 篩選和驗證 重要性狀 的關鍵基因，研究其作用機理和調控網(wǎng)絡，定位目標性狀基因 /QTL，明確基因型與表型關 系 。 廣泛的國際合作基礎 本項目的主要學術骨干同美國、法國等同行專家建立了良好的合作關系，在相關領域 深入開展了實質性合作研究。已率先開展了牡蠣 等 的 全基因組序列分析，進行 了櫛孔扇貝大規(guī)模 de novo 轉錄譜分析，篩查了大量的 SNP 和 SSR 標記，構建了多種貝類的遺傳連鎖圖譜，克隆了上百個重要性狀的貝類功能基因，建 立了貝類 BLUP 育種體系和性狀數(shù)據(jù)庫， 培育 了牡蠣、扇貝和珠母貝數(shù)百個不同性狀的家系，初步開展了重要經(jīng)濟性狀的基因定位和遺傳解析。在貝類已有的工作基礎上，本項目借鑒種植業(yè)、畜牧業(yè)已取得的成功經(jīng)驗，發(fā)揮貝類育種的材料優(yōu)勢，能確保實現(xiàn)項目的預期目標。 （三）創(chuàng)新點與特色 對 貝類基因組結構 與特征得到全新認識 率先建立 全基因組序列 圖譜，解析牡蠣等貝類基因組結構與特征，規(guī)模發(fā)掘功能基因和 SNP 標記，構建高密度遺傳圖譜。 貝類生長和發(fā)育的關鍵基因及其網(wǎng)絡調控機制 利用比較基因組學和生物信息學方法，基于牡蠣等全基因組序列信息篩查生長發(fā)育相關候選基因；應用不同發(fā)育階段基因表達譜、蛋白質組學等篩選鑒定參與調控貝類生長發(fā)育的關鍵功能基因， 利用 RNA 干擾、酵母雙雜交等技術查清基因信號通路及其調控網(wǎng)絡；應用連鎖分析和關聯(lián)分析，開展生長發(fā)育性狀相關的 QTL 定位，應用候選基因法獲得生長發(fā)育相關基因的功能 SNP 標記， 并確定基因型和表型的關系 。借助海洋貝類高繁殖力，可構建理想分析群體，以及易于誘導成多倍體等不同類型的遺傳材料，在水產學和水生生物學自身學科發(fā)展的基礎上，充分利用牡蠣等全基因組測序完成這一有利條件，結合生物信息學等學科的先進研究方法和技術，開展多學科交叉研究，發(fā)揮后發(fā)優(yōu)勢，借鑒現(xiàn)代生物科學的新概念、新觀點和新思路以及種植業(yè)、畜牧業(yè)等所取得的成功經(jīng)驗，創(chuàng)新起步較晚的海水貝類的分子設計育種理論和方法，從而帶動和推進水產育種領域基礎研 究水平提升，實現(xiàn)質的飛躍。 通過牡蠣全基因組序列及其與扇貝、珍珠貝基因組的比較研究， 全面了解貝類基因組結構與特征；在基因組水平大規(guī)模開發(fā)功能基因和 SNP 等標記，明確生長、發(fā)育、抗性和珍珠質形成等重要經(jīng)濟性狀的關鍵基因、作用機理和途徑，為剖析重要性狀的分子調控機制和網(wǎng)絡奠定基礎。 三、研究方案 （一）學術思路 本項目 針 對我國 海水養(yǎng)殖 業(yè)良種缺乏，遺傳育種基礎理論 薄弱 的現(xiàn)狀，凝練出貝類基因組 的 結構與特征、重要經(jīng)濟性狀的分子 解析 和分子設計 育種的技術途徑 等重大科學問題。 重要經(jīng)濟性狀的分子解析及網(wǎng)絡調控機理研究 定位重要經(jīng)濟性狀相關的功能基因 /QTL 200300 個，分析 QTL 的效應；篩選 150200 個與重要經(jīng)濟性狀緊密相關的功能基因，闡明 60100 個重要性狀關鍵基因的功能和調控機制，提 出 510 個基因調控模型；篩查 1015 個功能 SNP多態(tài)分子標記，明確其對性狀的遺傳效應，建立基因型與表型的關系。 篩選貝類生長、發(fā)育、抗性和珍珠質形成等相關的關鍵基因，闡明其功能和調控機制，解析性狀的基因調控網(wǎng)絡；闡明基因與性狀的關聯(lián)性。定位目標性狀基因 /QTL，明確基因型與表型關系。本關鍵科學問題包含 4 個重 要內涵： ① 基因、調控網(wǎng)絡對環(huán)境的反應； ② 育種性狀的 GP鏈接模型和數(shù)據(jù)庫； ③ 生長和抗性性狀的復合 /聚合； ④ 模擬育種平臺與育種驗證。本關鍵科學問題包含 3 個重要內涵： ① 基因組結構與 功能基因 ； ② 全基因組 SNP 和 功能基因 多態(tài)性 ； ③ 基因組序列圖譜和高密度遺傳圖譜 。 9. 評價利用魚類生殖、生長、抗病和 抗寒基因和分子標記進行分子設計育種可行性。 第 四 年 1. 魚類生殖、生長、抗病和抗寒的重要基因 的 功能分析； 2. 重要功能基因的啟動子分析； 3. 重要功能基因的信號傳遞及其調控機制研究； 4. 魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用 研究； 5. 雌核發(fā)育和近交家系中抗病性狀與抗病分子標記的關聯(lián)性分析及QTL 定位； 6. 建立多基因聚合的轉羅非魚載體，獲得轉基因子一代 ； 7. 繼續(xù)遺傳圖譜構建及其品系或不同作圖群體間的雜交、回交分析與測量； 8. 原生質 細胞操作相關的基因操作載體設計 ， 基因敲除純合體 的獲得 ； 9. 轉基因魚 F2 代的獲得和擴群 ， 不同轉基因 F2 代家系的生長比較和信號通路活性比較 ， 通過轉基因技術干1. 鑒定調控魚類生殖、生長、抗病和抗寒的功能基因或分子標記 410個； 23個重要基因在生殖質 的形成和遷移、卵母細胞成熟、卵胚轉換以及性別決定和分化中的 功能及其基因調控網(wǎng)絡 ； 3. 揭示 23 個重要基因在魚類生長中的功能及其基因調控網(wǎng)絡； 4. 揭示 23 個抗病關鍵基因表達產物在預防魚類病毒性和細菌性疾病中的作用及其機理；闡明抗病候選功能基因和分子標記與魚類抗病性狀的關系； 5. 闡明 13 個重要病原基因的生物學功能及其免疫原性； 6. 獲得能提高斑馬魚和羅非魚抗寒性能的多基因聚合體 ； 7. 獲得 MAPPING 標記 500 個以上；年度 研究內容 預期目標 擾原生殖細胞的正常發(fā)育 ， 小 RNA及其互作蛋白與靶基因的作用研究。 1. 鑒定調控魚類生殖、生長、抗病和抗寒的功能基因或分子標記 1015個； 2. 揭示差異順式調控序列與 相關基因啟動子差異甲基化修飾的關系及其功能特征； 3. 構建可控性性腺發(fā)育抑制轉基因穩(wěn)定遺傳品系； 4. 完成對養(yǎng)殖魚類肌肉組織中抑制抑肌素功能受阻的 F0個體篩選，并對其進行肌肉生長性狀特征的初步觀察； 5. 獲得構建牙鲆抗病性狀關聯(lián)分析基礎群體和 QTL作圖群體； 6. 獲得 3 個抗寒基因的 轉基因斑馬魚 F1 代 ； 獲得 5 個抗寒基因的 轉基因羅非魚 F0 代。 主要研究內容： 基于 BAC 克隆、轉座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉基因技術研究； 基于蛋白質鋅指結構魚類基因快速敲除系統(tǒng)的優(yōu)化和完善； 持續(xù)激活的生長激素受體的分子設計及其轉基因魚的研制； 轉持續(xù)激活生長激素受體基因魚與轉生長激素基因魚的效應及生長激素信號通路上下游關鍵因子的比較研究； 性腺特異的小分子 RNA 在性別分化中的動態(tài)特性及其作用機理研究； 基于破壞生殖細胞發(fā)生或維持的具有遺傳 安全的魚類轉基因技術體系研究。 主要研究內容： 魚類耐寒基因調控網(wǎng)絡、功能分析和作用機理研究； 不耐寒魚類低溫脅迫下基因表達譜與耐寒魚類基因表達譜的差異比較及其關鍵基因的鑒 定和功能研究； 耐寒與不耐寒魚類溫度適應調控機制的差異的解析； 魚類抗寒機理研究模型的研制； 魚類抗寒基因和分子標記用于魚類分子設計育種的可行性途徑研究。 承 擔 單 位 ： 中國科學院水生生物研究所、浙江大學 課題負責人 ： 桂建芳 主要學術骨干 ： 周莉、羅琛、汪洋、鄭康、李忠、李志、魏麗華 經(jīng)費比例： 25% 課題 2 魚類生長基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 主要研究目標： 闡明魚類下丘腦 /垂體控制生長的基因調控網(wǎng)絡；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調及其調控機理；闡明腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調控機制；揭示卵泡抑素等抑肌素相關基因在調控魚類肌肉細胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機理；研制出可控不育性轉卵泡抑素等基因的轉基因魚品系；闡明魚類個體大小調控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化規(guī)律；開拓生長基因調控網(wǎng)絡和分子標記尤其是主控基 因用于魚類分子設計育種的可行性途徑。 項目的主要研究內容、課題設置和課題間的聯(lián)系 與項目擬解決的關鍵科學問題和總體目標的 學術思路圖 項目設置的 6 個課題是： 課題 1 魚類生殖基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究； 課題 2 魚類生長基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究； 課題 3 魚類抗病基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究； 課題 4 魚類抗寒基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究； 課題 5 魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術研究； 魚類主要經(jīng)濟性狀的功能基因組 魚類生殖功能基因組 魚類分子設計育種的策略和理論基礎 魚類生長功能基因組 魚類抗性功能基因組 主要研究內容 解決的關鍵科學問題 總體目標 魚類生殖基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 魚類生長基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的 基礎研究 魚類抗病基因調控網(wǎng)絡和分子設計育種的 基礎研究 魚類 抗寒基因 調控網(wǎng)絡和分子設計育種的 基礎研究 課題設置的 思 路 魚類分子設計育種的基因操作技術研究 魚類數(shù)量