【正文】 gag att cct tct gac ctc ， tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg 和 agg aat gcc att gaa ctg agg ttt gtc ctc）分別導(dǎo)入 f88–4 噬菌體，然后 轉(zhuǎn)染 MC1061 大腸桿菌， 培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染大腸桿菌使其大量繁殖； 從大腸桿菌中提取擴(kuò)增的噬菌體， 從 部分 噬菌體中提取總蛋白，分離 FSHR 多肽，計算 FSHR 多肽占噬菌體總蛋白的百分含量（至少為 60%70%），親和柱層析純化，聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶分析，質(zhì)譜分析確定多肽序列的正確性，鑒定多肽的等電點及分子量 。 四、任務(wù)分解與考核指標(biāo) （一） 課題研究內(nèi)容、技術(shù)路線和創(chuàng)新點 1． 課題研究內(nèi)容 疫苗的制備 FSHR 多肽疫苗的制備 FSHR 全長 695 個氨基酸，空間結(jié)構(gòu)研究表明 FSHR 有多個功能區(qū)域，而其中的一個區(qū)域與 FSHR 和 FSH 的結(jié)合密切相關(guān)，序列高度特異。 本課題的研究內(nèi)容一直是國家和江蘇省 關(guān)注 的重點，在我校也有著深厚的研究基礎(chǔ) 。 本課題組由來自中國、 美國、 法國的多名中青年專家組成，他們多年來從事生殖醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科相關(guān)研究，積累了 相當(dāng) 豐厚的 研究成果和成熟的技術(shù)方法 ，他們良好的科研素質(zhì)、極大的工作熱情和敬業(yè)精神，使本課題組成為具有良好發(fā)展前景和合作精神的科研團(tuán)隊。此外，本實驗室還具備 多種男性不育的診斷技術(shù) 如 CASA、 Y 染色體 15 微缺失 、 Y 染色體 和 mtDNA 單倍群 等 ； 多種 ECPs 內(nèi)暴露 生物學(xué) 標(biāo)志分析 如 LCMSMS， GCMS等 ； 高端遺傳學(xué)分析技術(shù) 如 FISH、 CGH、 MFISH； 激素受體介導(dǎo)的 ER、 AR 和 TR 報告基因試驗方法等 。研究方法成熟，有望達(dá)到預(yù)期目的。 雖然法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 Remy 博士和美國北卡大學(xué) O’ Rand 教授分別首次對 FSHR 多肽和Eppin 蛋白疫苗的避孕效果進(jìn)行了初步研究，但均未申請相關(guān)專利； 目前國內(nèi)外 也 均未見 其它 有關(guān) FSHR 多肽 疫苗 和 Eppin 蛋白疫苗的專利 ； 通過本研究擬申請 有關(guān) FSHR 多肽和 Eppin蛋白疫苗的工藝流程、純化與鑒定方法、抗體檢測方法與相應(yīng) 試劑盒、 FSHR 多肽 疫苗、 Eppin蛋白疫苗 及其 聯(lián)合使用方法等專利。 本項目在充分借鑒目前國內(nèi)外有關(guān)免疫疫苗（包括女性避孕疫 苗和腫瘤疫苗）的理論和技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗室多年來在生殖醫(yī) 學(xué)方面的研究積累，并通過與法國農(nóng)科院 Remy博士和 和美國北卡大學(xué) O’ Rand 博士 的緊密合作，聯(lián)合開發(fā) FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗，為開辟 男性避孕 新 途徑進(jìn)行積極有效的探索。可見， Eppin 是一種極有發(fā)展前途的男性避孕 疫苗 。Rand 以猴作為雄性免疫避孕模型進(jìn)行了研究 ?？?Eppin抗體干擾了正常 Eppin 對精子表面和 精囊凝固蛋白 （ semenogelin） 的相互作用及其對附睪上皮的保護(hù)，影響精子成熟和射精后固化 , 從而發(fā)揮抗生育作用。 Eppin 基因于 2022 年首先在人類發(fā)現(xiàn)，它 定位 于 人類 20 號染色體，可表達(dá)于精子細(xì)胞表面。 附睪是精子獲能和成熟的場所，后者通過 結(jié)構(gòu)功能改變來獲得受精和生育力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 4 只成年雄猴血清中均出現(xiàn)了高滴度抗體，且都不能使雌猴受孕，且不影響雄激素分泌和性功能，亦未見副作用。同時，該抗體并不影響 LH 的功能。 Moudgal 等 [14]用 FSHR的 1134 氨基酸片段（ oFSHRP）重組抗原對 3 只成年雄猴進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 3 只被免疫雄猴的血清中都出現(xiàn)了高滴度抗體，交配后雌猴均未受孕，免疫停止后所有雄猴都恢復(fù)了生育能力。 FSHR 由 695 個氨基酸組成，包括一個大的 N 區(qū)、 7 個跨膜區(qū)和一個小的 C 區(qū) [13,15]。 生殖激素疫苗包括 GnRH 和卵泡刺激素（ FSH）疫苗， GnRH 疫苗 可能導(dǎo)致生殖器官功能的減退，造成雌性骨質(zhì)疏松和雄性體重下降，顯然不適合人類； FSH 疫苗目前正 進(jìn)行 I 期臨床試驗，但足夠數(shù)量的 FSH 來源有限，因此 FSH 疫苗還有待于進(jìn)一步研究。迄今為止，通過多種方法篩選出具有干擾精卵識別和抗生育作用精子特異性蛋白，其中值得注意的是受精抗原（ FA1）、透明質(zhì)酸酶 PH精子蛋白受精素（ PH30）、精子蛋白（ SP SP17）、睪丸特異性抗 原 1（ TSA1）、避孕疫苗源、蛋白激酶 A 錨定蛋白（ AKAP）以及精子相關(guān)抗原 9（ SPAG9）。目前，人們 已 從精子和生殖激 素中篩選出一些 適宜的 靶抗原用于 研 發(fā)免疫避孕疫苗如抗 精子疫苗、激素疫苗等。 13 應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)的原理研 究 開發(fā) 的免疫疫苗，由于具有靶特異性強(qiáng)、藥效持續(xù)時間長等優(yōu)點，已成為目前腫瘤治療的主要發(fā)展方向，也是當(dāng)前女 性避孕途徑研究中的熱點，有些疫苗 已進(jìn)入臨床試驗階段并有望近年內(nèi)投放市場。殺精子劑作為一種新型藥物，由于人們對它缺乏了解，對產(chǎn)品 的 可接受度 低 等，都將影響殺精子劑的最終使用效果。但無論是單獨使用還是聯(lián)合使用，其產(chǎn)生的避孕效果仍難以達(dá)到要求。 男用避孕 藥包括非激素類和激素類，而過去幾十年來男性避孕藥的研究主要集中 于 干擾男性性激素，通過增加體內(nèi)睪丸激素的含量來阻止或抑制精子 發(fā)生 。因此， WHO 等國際 組織均十分重視對男性避孕新途徑的探索。有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球 (特別是發(fā)達(dá)地區(qū) )約 1/3 的育齡夫婦采取男性避孕，社會調(diào)查也發(fā)現(xiàn)越 來越多的男性愿意同其配偶共同承擔(dān)計劃生育的任務(wù)。 三、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)與優(yōu)勢 1．國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)、知識產(chǎn)權(quán)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀及預(yù)期分析 隨著我國和世界人口規(guī)模的不斷擴(kuò)大，積極采取安全、有效避孕節(jié)育措施以控制人 口數(shù)量、提高人口質(zhì)量及全民健康水平已迫在眉睫， “ 避孕節(jié)育 ” 研究已成為生殖健康領(lǐng)域 “ 十大挑戰(zhàn) ” 之一。 C．避 孕效果和毒副作用的預(yù)評價： 該部分內(nèi)容將為疫苗的有效性和安全性評價提供重要參考，通過預(yù)評價， 建立合適的評價指標(biāo)和評價體系，使正式的研究更富有效率。主要的問題有： A． 疫苗的使用量、免疫途徑、間隔時間的確定： 以實驗動物體內(nèi)（主要指血液）產(chǎn)生特異性抗體的滴度、動力學(xué)變化特征為指征，求得最佳免疫劑量、免疫途徑和免疫程序。 此外，通過建立穩(wěn)定、可靠的 噬菌體 和細(xì)胞株，確立系統(tǒng)穩(wěn)定的制備方法，可以有效地保證疫苗的質(zhì)量，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及不同批次間的一致性 ，開發(fā)出成熟的疫苗。而且程序簡單、純化效率高，也適合于產(chǎn)品的批量生產(chǎn)和市場推廣。 Eppin 蛋白 系運用細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行 高效 表達(dá)， 蛋白的表達(dá)量能滿足疫苗生產(chǎn)的需要。由于后兩種方法成本高、產(chǎn)品效率低，可能導(dǎo)致成本增加，為產(chǎn)品的推廣帶來障礙。 2．課題目標(biāo)與任務(wù)解決的主要技術(shù)難點和問題分析 1） FSHR 多肽和 Eppin 蛋白的純化 得到高純度的 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白 是疫苗制備的關(guān)鍵，也是疫苗避孕效果的重要保證。 本課題組通過與法國農(nóng)科院和美國北卡大學(xué)的合作，初步闡明這兩種疫苗具有確切 11 的避孕效果，本研究屬疫苗系統(tǒng)、深入的研究與開發(fā)。 FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗主要作用于睪丸和附睪組織，分別通過阻斷精子生成、影響精子發(fā)育、成熟、運動以及精卵結(jié)合等而達(dá)到避孕目的；由于其作用的靶點為睪丸和附睪組織，屬于非激素類疫苗，因而與現(xiàn)有開發(fā)的傳統(tǒng)疫苗相比，其副作用將大大降低，是極具發(fā)展?jié)摿Φ哪行员茉蟹椒ā?由于 男性在 “ 避孕節(jié)育 ” 方面扮演著越來越重要的角色，研究和開發(fā)新型男性避孕藥具，不僅符合社會發(fā)展的需要，更具有廣闊的市場前景。本項目 符合《綱要》中有關(guān) “人口與健康 ”研究領(lǐng)域的要求和人民的需求， 有望 在 男性避孕研究領(lǐng)域取得重大突破 ， 研究成果 具有重要的理論價值和 廣闊的應(yīng)用前景，必將產(chǎn)生重大的社會效益和 經(jīng)濟(jì)效益。本項目擬在評價單個疫苗的基礎(chǔ)上，探討兩疫苗 聯(lián)合使用的效果 。 本項目在充分借鑒目前國內(nèi)外有關(guān)免疫疫苗（包括女性避孕疫 苗和腫瘤疫苗）的理論和技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗室多年來在生殖醫(yī)學(xué)方面的研究積累，并通過與法國農(nóng)科院和美國北卡羅來那 大學(xué)的緊密合作，聯(lián)合開發(fā) FSHR 多肽和 Eppin 蛋白疫苗。近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Eppin 與精子的發(fā)育和成熟有關(guān) ， 它可以阻止精子蛋白酶對附睪上皮細(xì)胞的損害， 進(jìn)而維持精子成熟 所需的 正常 附睪液體環(huán)境；此外， Eppin 在調(diào)控精子功能和存活上起重要作用。 FSHR疫苗已被初步證明可引起猴的生精障礙及完全不育， 但 不影響其雄激素 分泌和性功能， 亦未見副作用， 可 望 作為一種安全、有效、可逆 的男性避孕疫苗 。雖然近年來男性避孕藥具的研制不斷取得