【正文】 發(fā)表了一系列SCI 收錄文章。提出了一種發(fā)酵法聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的新工藝， 探索了發(fā)酵和光合耦合法高效產(chǎn)氫體系，并對秸桿生長 細胞和產(chǎn)氫菌株的基因工程改造進行了可行性研究， 使系統(tǒng)的能源轉化率獲得突破性提高。在 生物質(zhì)及 固體有機廢棄物的微生物法產(chǎn)氫研究領域， 承擔了一項國家自然科學基金項目 “城市固體有機廢棄物以微生物發(fā)酵法聯(lián) 產(chǎn)氫氣和甲烷的機理研究 ”、 1 項 全國優(yōu)秀博士學位論文作者專項資金資助項目、 1 項霍英東優(yōu)選資助基金項目和 1 項浙江省科技攻關項目 。 現(xiàn)有研究基礎 浙江大學能源清潔利用國家重點實驗室在生物質(zhì)能源化利用方面具有深厚的研究基礎，在生物質(zhì)的能源化高效轉化和清潔利用方面取得了突出業(yè)績。通過轉基因在植物中表達纖維素酶和運用表達纖維素結合蛋白改變纖維素的結構來降低在生物質(zhì)降解中酶制劑的用量。 （ 2）在 產(chǎn)氫菌中剔除乳酸等不利于產(chǎn)氫的基因片段，導入 產(chǎn)氫酶 [Fe]hydrogenase 基因片段 。 （ 8）研究轉基因秸桿接種轉基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫量、速率和濃度等，探索實現(xiàn)其最大能源轉化率的控制原理。 （ 6）研究轉基因新型產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫機制及其代謝條件，加入抑制劑提高產(chǎn)氫代謝過程中 NADH 含量， 通過控制代謝途徑的導向直接為氫酶提供還原力， 以 增強其產(chǎn)氫效率 。 （ 4）同時通過克隆 [Fe]hydrogenase 基因，在產(chǎn)氫細菌中轉入 [Fe]hydrogenase 基因，提高產(chǎn)氫酶表達水平，進一步增強產(chǎn)氫效率。 （ 2）培養(yǎng)篩選高效產(chǎn)氫菌株， 研究其發(fā)酵產(chǎn)氫的反應動力學，對其進行純化、分離和鑒定，研究其生理生態(tài)學特征以及最佳的代謝反應條件。 參考文獻： [1] Gadab C. Ghosh Biswas, Callista R, et al. Expression of biologically active Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in transgenic maize plants. Plant Science, 2020 (In press). [2] J. Mishra, N. Kumar, . Ghosh, D. Das. Isolation and molecular characterization of hydrogenase gene from a high rate of hydrogenproducing bacterial strain Enterbacter cloacue IITBT 08. International Journal of Hydrogen Energy 27 (2020) 1475– 1479. [3] Lindblad P, Christensson K, Lindberg P,et al. Photoproduction of H2 by wildtype Anabaena PCC 1720 and a hydrogen uptake deficient mutant。歐洲專利 WO2020062130 [12] 在一株含有 甲酸鹽脫氫 酶基因 (formate dehydrogenase gene)和氫化酶基因的菌株內(nèi)植入一種活性劑基因 ，從而提高了甲酸的產(chǎn)氫量。日本專利 JP2020202482 [10]報道了從梭菌 Clostridium paraputrificum 中得到一種具有特殊 堿基序列 的氫化酶基因 ， 將其植入寄主細胞進行基因重組可提高產(chǎn)氫量?，F(xiàn)代分子生物學的發(fā)展已經(jīng)可以操作電子呼吸鏈，因此通過基因工程手段改變代謝途徑，從而大大提高產(chǎn)氫效率的夢想是完全有可能實現(xiàn)的。 目前普通的產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫量僅為 molH2/mol 葡萄糖，但是 Tanisho 等推測通過加入一種抑制劑使 NADH脫氫酶絡合物 不能形成則 NADH 的氧化步驟被阻斷而 FADH2 的氧化不受影響，從而使三羧酸循環(huán)所產(chǎn)生的 NADH 用于產(chǎn)氫，從理論上可望實現(xiàn)每摩爾葡萄糖產(chǎn) 10 mol 氫氣 [89]。目前已知的發(fā)酵制氫的產(chǎn)氫途徑包括甲酸途徑、丙酮酸途徑和 NADH 途徑。但是這一方法目前還只能在體外進行，成本相當高。 運用代謝工程手段等現(xiàn)代生物技術手段對 產(chǎn)氫細菌進行改造的研究目前在生物制氫領域還沒有展開，是很值得深入研究的方向。任南琪教授在其 CSTR 反應器中分離出一株產(chǎn)氫發(fā)酵細菌 ZGX4，以其為出發(fā)菌株，對其進行紫外和亞硝酸復合誘變選育，經(jīng)過連續(xù)傳代得到一株遺傳穩(wěn)定很好的高效產(chǎn)氫突變株 YR1，產(chǎn)氫能力 提高 35％，平均產(chǎn)氫速率提高 23％ [5]。 通過復合誘變選育，得到遺傳穩(wěn)定好的高效產(chǎn)氫突變株，并提高菌種對環(huán)境的耐受力，在高產(chǎn)氫菌種的選育中耐高溫或耐酸菌是值得重視的一個育種方向。 Lindblad[3]已將這一策略應用到光合細菌 Anabaena PCC7120 中，敲掉了其中的吸氫酶 HupL 基因片段，使產(chǎn)氫速度比野生型高出 了兩倍。單純的條件優(yōu)化手段已不能滿足這一要求，需要運用分子生物學的手段對菌種進行改造，以達到高效產(chǎn)氫的目的。雖然一部分氫酶基因得到解析，但是整體進展仍然比較緩慢而且不系統(tǒng)，有很大的研究探索空間。大腸桿菌的氫酶基因都屬于 Ni． Fe 氫酶，梭菌屬的氫酶都屬于鐵氫酶，目前其中 3 株所具有的鐵氫酶得到測序，但是關于其附屬基因、調(diào)控機制還不清楚。目前已經(jīng)有超過 100 種的氫酶基因序列可以在基因庫上獲得，但是仍然有大量已知產(chǎn)氫菌株的氫酶基因尚未克隆，獲得更多的氫酶基因也是生物制氫研究的重要方向。 厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫中起主要作用的是氫酶，氫酶分為放氫酶和吸氫酶，分別催化反應222 HHe ??? 的正逆反應。若能通過基因工程手段在目標 植株細胞 中成功表達降解不同生物體高分子的酶，如 將纖維素酶基 因片段植入水稻的基因組中，而在收獲的水稻秸稈中獲得大量纖維素酶，使得秸桿在后續(xù)的加熱到 90℃左右水解過程中不需要酸堿預處理和外加纖維素酶等，即能高效降解成產(chǎn)乙醇細菌或產(chǎn)氫細菌直接可資利用的小分子還原糖，則能大幅度降低 秸桿水解糖化和發(fā)酵利用的處理成本，并大幅度提 高其轉化效率， 取得巨大的經(jīng)濟和社會效益。目前國際上 最新的研究方向是 從現(xiàn)有產(chǎn)氫純菌的工藝優(yōu)化中走出來，開發(fā)新的產(chǎn)氫菌種，通 過基因工程改造產(chǎn)氫菌及氫酶，并開發(fā)高效的產(chǎn)氫反應器。而生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫能否獲得產(chǎn)業(yè)化應用的 瓶頸問題是 過程的經(jīng)濟性，即如何降低發(fā)酵制氫的成本，使之可以和化石能源催化重整制氫的經(jīng)濟性相比擬，或者可以與其他生物能源過程（即生物制甲烷、燃料酒精、生物柴油）相競爭。而國內(nèi)對于固體有機廢棄物發(fā)酵產(chǎn)氫的研究才剛剛起步，如中國科學院、清華大學、中國科技大學、廈門大學、哈爾濱工業(yè)大學、鄭州大學等曾對固體廢棄物發(fā)酵產(chǎn)氫進行了一些探索性研究，取得 了一定的研究成果。日本東北大學 曾將餐廳剩菜與糞便污泥混合配成培養(yǎng)基料，利用加熱預處理的厭氧活性污泥和大豆粉倉中富含的產(chǎn)氫菌進行發(fā)酵制氫，發(fā)現(xiàn)底料的產(chǎn)氫潛力分別高達 140ml/g 和 180ml/g，而厭氧活性污泥的接種產(chǎn)氫速率可高達 45ml/（ gVSS?h）， 2020 年日本產(chǎn)業(yè)技術研究所的廢棄食物產(chǎn)氫項目已經(jīng)進入中試階段。后者的厭氧消化產(chǎn)氫過程可分為水解、酸化和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸三個階段，由于其降解產(chǎn)氫過程的復雜性，國內(nèi)外在該領域的研究方興未艾，目前已逐步引起許多學者的高度重視。因此， 利用秸桿等生物質(zhì)以微生物法制氫對發(fā)展清潔高效的可再生能源和減少環(huán)境污染具有重要意義， 是一個處于國際學術前沿的十分活躍的熱點課題， 具有重要的學術價值和應用前景。它克服了常規(guī)制氫方法（如從煤、石油、天然氣等化石燃料中提取或通過水電解法制取等）需要消耗大量化石燃料和能量、并且產(chǎn)生大量污染的弊病。預期目標是使轉基因秸桿接種轉基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫能力和能源轉化率獲得突破性提高。研究轉基因新型產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫機制及其代謝條件，加入抑制劑提高產(chǎn)氫代謝 過程中 NADH 含量，通過控制代謝途徑的導向直接為氫酶提供還原力，以增強其產(chǎn)氫效率。其次培養(yǎng) 篩選高效產(chǎn)氫菌株，通過 knock out 技術，剔除產(chǎn)氫細菌 Enterobacter aerogenes 的乳酸脫氫酶（ ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細菌在代謝過程中形成乳酸等的有效途徑；同時通過克隆 [Fe]hydrogenase 基因，在產(chǎn)氫細菌中轉入[Fe]hydrogenase 基因，提高產(chǎn)氫酶表達水平。因此，本項目提出基因工程改造秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫的關鍵技術研究。 如何使富含纖維素的秸桿等生物質(zhì)高效降解成可資利用的還原糖是利用其發(fā)酵產(chǎn)氫的首要技術難點和重大關鍵