【正文】 pH 值、氧化還原電勢(shì)和溫度等參數(shù)對(duì)產(chǎn)氫過程的影響，優(yōu)化反應(yīng)器運(yùn)行條件。 擬解決的技術(shù)難點(diǎn) （ 1）獲得轉(zhuǎn)基因水稻種子和植株，在獲得高產(chǎn)量稻谷的同時(shí)能產(chǎn)生成功表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶的秸稈。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) （ 1） 利用轉(zhuǎn)基因植物自身表達(dá)的酶達(dá)到植物細(xì)胞壁的自身降解，省去傳統(tǒng)方法中的酸或堿預(yù)處理。 （ 2） 通過基因剔除和導(dǎo)入，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌代謝通道中乳酸等不利于產(chǎn)氫的代謝途徑， 增強(qiáng)產(chǎn)氫酶 [Fe]hydrogenase 的基因表達(dá)水平，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)氫效率 。 申請(qǐng)者程軍副教授和劉建忠教授長期 從事生物質(zhì)和化石能源的高效轉(zhuǎn)化和清潔利用研究工作， 曾經(jīng)承擔(dān)和參加了多項(xiàng)國家及省部級(jí)重大科研項(xiàng)目， 具有較強(qiáng)的科研工作能力，并積累了豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。并已取得了一定的研究成果：實(shí)驗(yàn)研究了 產(chǎn)氣腸桿菌在不同固定化條件下的發(fā)酵產(chǎn)氫特性；研究了 富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等三類大分子有機(jī)質(zhì)的廢棄食物發(fā)酵產(chǎn)氫特性； 研究了 不同來源的活性污泥對(duì)不同方法預(yù)處理的稻草秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫特性的影響規(guī)律；研究了以厭氧活性污泥為接種物時(shí)各種反應(yīng)條件對(duì)水葫蘆發(fā)酵產(chǎn)氫的影響規(guī)律。在該領(lǐng)域目前 已發(fā)表和錄用學(xué)術(shù)論文 7篇，其中 EI 收錄 1 篇，中文重要期刊 4 篇。在細(xì)菌和病毒基因組基因剔除研究方面，建立了高效的 ET 重組系統(tǒng)和 pBADgbaA 重組系統(tǒng) ,并在大腸桿菌中構(gòu)建了桿狀病毒人工染色體，通過ET 重組，在大腸桿菌 Bacmid 中剔除了 Bm79, Bm11Bm9, chitinase 等一系列基因。 浙江大學(xué)種質(zhì)創(chuàng)新和分子育種平臺(tái)具有良好的分子育種條件，是“ 211”和“ 985”建設(shè)平臺(tái)。擁有300 平方米的智能溫室。因此， 本課題組對(duì)于產(chǎn)氫細(xì)菌和水稻秸桿的基因改造研究具有深厚的專業(yè)理論背景 和扎實(shí)的研究實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。篩選培養(yǎng)高效產(chǎn)氫菌株，通過 knock out 技術(shù)，剔除產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes 的乳酸脫氫酶（ ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌在代謝過程中形成乳酸等的有效途徑；同時(shí)通過克隆 [Fe]hydrogenase 基因，在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入 [Fe]hydrogenase 基因，提高產(chǎn)氫酶 表達(dá)水平。 設(shè)計(jì)出高效產(chǎn)氫反應(yīng)器并優(yōu)化其運(yùn)行條件，使轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫能力和能源轉(zhuǎn)化率獲得 突破性提高 。 在產(chǎn)氣腸桿菌的基因組中 通過基因剔除和導(dǎo)入，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌代謝通道中乳酸 等不利于產(chǎn)氫的代謝途徑， 增強(qiáng)產(chǎn)氫酶 [Fe]hydrogenase 的基因表達(dá)水平， 從而獲得高效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氣腸桿菌，發(fā)酵 產(chǎn)氫量提高到 3 molH2/mol 葡萄糖以上， 產(chǎn)氫效率提高 50%以上。 人才培養(yǎng) 擬培養(yǎng) 1名青年骨干教師列入教育部新世紀(jì)人才或省級(jí) 151人才以上計(jì)劃； 擬培養(yǎng)博士研究生 4名，碩士研究生 4名。在植物中表達(dá)熒光蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合蛋白的融合蛋白質(zhì)，使其與纖維素結(jié)合，從而使秸稈中的纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在植物中表達(dá)抗高溫纖維素酶和半纖維素酶，表達(dá)了這些酶的農(nóng)作物秸稈在收獲過程中或者其后經(jīng)過高溫（ 90℃左右）處理，實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素和半纖維素高效水解成直接可供產(chǎn)氫菌利用的小分子還原糖，從而為秸稈的高效轉(zhuǎn)化提供更好的起始材料。通過分子生物學(xué)中應(yīng)用成熟的細(xì)菌 ET 重組修飾系 統(tǒng)， 轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫細(xì)菌，構(gòu)建可重組產(chǎn)氫細(xì)菌。 利用 knock out 等技術(shù)，剔除產(chǎn)氫細(xì)菌 Enterobacter aerogenes 的乳酸脫氫酶（ ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌在代謝過程中形成乳酸等的途徑，從而達(dá)到加強(qiáng)產(chǎn)氫途徑的效應(yīng)。 通過 CAT 抗性標(biāo)記，篩選重組的產(chǎn)氫細(xì)菌，通過系列 PCR，鑒定 ldh 被剔除的產(chǎn)氫細(xì)菌并 轉(zhuǎn)入 [Fe]hydrogenase，測(cè)定基因改造后產(chǎn)氫細(xì)菌的產(chǎn)氫效率和性狀。 研究轉(zhuǎn)基因新型產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)制及其代謝條件，加入抑制劑提高產(chǎn)氫代謝過程中 NADH 含量， 通過控制代謝途徑的導(dǎo)向直接為氫酶提供還原力， 以 增強(qiáng)其產(chǎn)氫效率 。對(duì)各個(gè)階段產(chǎn)氫反應(yīng)器的終端氣相和液相產(chǎn)物定期取樣，送入氣相色譜儀和色質(zhì)聯(lián)機(jī)分析成分， 考察 pH 值、氧化還原電勢(shì)和溫度等參數(shù)對(duì)產(chǎn)氫過程的影響，優(yōu)化反應(yīng)器運(yùn)行條件。 可行性分析 目前美國麻省理工學(xué)院、密歇根州立大學(xué)、加州大學(xué) Davis 分校、 杜邦公司和 Syngenta公司等正在加緊研究在玉米、甘蔗等植株 中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶，以獲得更有利于秸稈高效水解 糖化的農(nóng)作物。 本課題組長期致力于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因改良研究，對(duì)在水稻中通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)纖維素酶進(jìn)行了多年富有成效的研究，承擔(dān)了相關(guān)的國家杰出青年基金和國際合作項(xiàng)目，目前已經(jīng)成功獲得表達(dá)了纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻苗。 本課題組長期從事分子生物學(xué)和基因工程研究，對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行基因組分析，基因表達(dá)、調(diào)控、刪除、蛋白互作等進(jìn)行了深入的研究。近年來 致力于產(chǎn)氫菌株的基因工程改造研究并取得了一定成果。項(xiàng)目研究目標(biāo)明確，技術(shù)路線合理，實(shí)驗(yàn)方案可行，關(guān)于該項(xiàng)目基因工程改造所涉及的關(guān)鍵技術(shù)本課題組已完全掌握，因此能夠順利完成研究任務(wù)，實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo) 。（包括纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)，纖維素酶等基因） 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物， 檢測(cè)轉(zhuǎn)入基因在 水稻中的表達(dá)水平和生物化學(xué)活性。并與非轉(zhuǎn)基因作物比較，研究轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化成本的差異。各種主要農(nóng)作物（稻桿、麥桿、玉米桿等）總量為 億噸，農(nóng)業(yè)加工廢棄物（稻殼、蔗渣等）約為 億噸，薪材及林業(yè)加工剩余物合理資源量為 億噸，人畜糞便生物質(zhì)資源總量為 億噸，城市生活垃圾污水中的有機(jī)物約 億噸。大部分生物質(zhì)被直接燃燒或廢棄，利用水平 低，浪費(fèi)嚴(yán)重，并且污染環(huán)境，因此如何高效清潔地利用生物質(zhì)能成為我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。 通過本項(xiàng)目研究，在水稻等種子和植株莖桿中成功表達(dá)纖維素酶等高效降解酶的基因片段，獲得能夠在加熱到 90℃ 左右環(huán)境中自身高效水解的轉(zhuǎn)基因秸桿，從而省掉成本高而且污染大的酸堿預(yù)處理，并且在水解過 程中能夠減少外加纖維素酶 制劑 的用量 50%以上。 設(shè)計(jì)出高效產(chǎn)氫反應(yīng)器，使轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫能力和能源轉(zhuǎn)化率獲得突破性提高。如將氫氣產(chǎn)品供給燃料電池作為汽車發(fā)動(dòng)機(jī)，替代目前廣泛使用的燃用汽油和柴油的內(nèi)燃機(jī)，能夠?yàn)楦咝鍧嵖寺‘a(chǎn)氫細(xì)菌 Enterobacter aerogenes 的乳酸脫氫酶（ ldh）等基因及其側(cè)翼序列，以 CAT 為報(bào)告基因，構(gòu)建基因重組片段 將含 recα , recβ , recγ 的ET 重組系統(tǒng)轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫細(xì)菌，構(gòu)建可重組產(chǎn)氫細(xì)菌。將氫氣供給燃料電池建設(shè)大型電站，也是未來清潔電力生產(chǎn)的一個(gè)重要方向。 、課題組現(xiàn)有及依托單位承諾提供的支撐條件，其他所需增添的支撐條件和主要儀器設(shè)備（說明用途） 本項(xiàng)目主要依托浙江大學(xué)的能源清潔利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)業(yè)生物學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。由岑可法院士領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)多年來長期從事生物質(zhì)、城鄉(xiāng)固體廢棄物以及化石能源的清潔利用及高效轉(zhuǎn)化研究工作 ，承擔(dān)了多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金、 973 項(xiàng)目、 863 項(xiàng)目、國家及省部級(jí)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目以及國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程等，在生物質(zhì)及固體廢棄物方面具備完善的研究手段和物質(zhì)條件。主要購置了 5L4 臺(tái)并聯(lián)發(fā)酵罐、英國DWSminiMACS 型厭氧操作箱、北分瑞利 SP3400 氣相色譜儀、日本 Nikon50i 顯微鏡、以及超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、 培養(yǎng)振蕩器、恒溫水浴鍋、酸度計(jì)、高速離心機(jī)、分光光度計(jì)、冷藏保存箱等儀器設(shè)備，建有生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)裝置，配備了兩臺(tái)美國 Thermo Finigan Trace 2020 氣相色譜儀用于分析發(fā)酵產(chǎn)生的氣相和液相組成，擁有裝備較為齊全的微生物制氫實(shí)驗(yàn)室。配備有 Hitachi 低溫超速， Sorval 和 Beckman 等低溫高速離心機(jī) 8 臺(tái)、 PCR 儀、測(cè)序系統(tǒng)、MBA2020 微量蛋白核酸測(cè)定計(jì)算體統(tǒng)、蛋白電泳和蛋白核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、 Amersham 蛋白分離純化系統(tǒng)、冷凍干燥系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、磷光熒光分光光度計(jì)、電擊穿孔轉(zhuǎn)移器、熒光相差顯微鏡、超低溫冰箱、 BioRad脈沖電泳系統(tǒng)、氣相和液相色譜、熒光酶標(biāo)儀、全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng)、熒光 /化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)等本研究所需要的基本儀器，并且配有細(xì)胞培養(yǎng)室。浙江大學(xué)種質(zhì)創(chuàng)新和分子育種平臺(tái)具有良好的分子育種條件，是教育部“211”和 “985”重點(diǎn)建設(shè)平臺(tái)，擁有 300m2 的智能溫室，水稻等農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室能夠全年產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，目前已經(jīng)獲得了成功表達(dá)纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻苗。