【正文】 er aerogenes 的產(chǎn)氫酶重組入非產(chǎn)氫抗性菌的基因組，獲得耐酸性和其它對(duì)環(huán)境耐受力強(qiáng)的產(chǎn)氫菌株。設(shè)計(jì)高效產(chǎn)氫反應(yīng)器并優(yōu)化其運(yùn)行條件，研究 pH 值、氧化還原電勢(shì)和溫度等對(duì)轉(zhuǎn)基因秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程的影響規(guī)律和控制機(jī)理。 、課題主要研究技術(shù)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢(shì)，課題主要研究技術(shù)國(guó)內(nèi)外專利申請(qǐng)和授權(quán)情況 國(guó)際上許多國(guó)家投入巨資研究的微生物制氫是一項(xiàng)利用微生物的生理代謝作用分解有機(jī)物從而生產(chǎn)氫氣的生物工程技術(shù)，它是一種符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的可 再生能源技術(shù)。目前在生物法制氫研究方面主要分為發(fā)酵法和光合法兩大類，其中發(fā)酵法具有產(chǎn)氫細(xì)菌生長(zhǎng)速率快、產(chǎn)氫能力高、反應(yīng)無(wú)需光源、發(fā)酵底料來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)，所以更容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)產(chǎn)氫和工業(yè)化 生產(chǎn) 。 國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者關(guān)于發(fā)酵法產(chǎn)氫 的研究范圍主要局限于反應(yīng)機(jī)理相對(duì)簡(jiǎn)單的富含水溶性碳水化合物（尤其是葡萄糖）的有機(jī)廢水，對(duì)于主要由復(fù)雜大分子有機(jī)質(zhì)即不溶性的大分子碳水化合物、脂類物和蛋白質(zhì)組成的生物質(zhì)及固體有機(jī)廢棄物的發(fā)酵產(chǎn)氫問(wèn)題較少研究。國(guó)外已有部分相關(guān)報(bào)道，如日本在 90 年代末到本世紀(jì)初，在暗發(fā)酵制氫方面的科研投入大大增加，尤其在 20202020 年產(chǎn)生了大量基礎(chǔ)性的研究結(jié)果。另外，韓國(guó)、新加坡、印度在此領(lǐng)域的研究也比較活躍。眾多專家一致認(rèn)為：如何使生物質(zhì)及固體廢棄物高效降解成可資利用的還原糖是利用其發(fā)酵產(chǎn)氫的首要技術(shù)難點(diǎn)和重大關(guān)鍵點(diǎn)。其 核心問(wèn)題是 如何提高氫氣從葡萄糖的轉(zhuǎn)化率、如何降低底物成本、以及如何在生物反應(yīng)器水平上實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)氫。 利用富含纖維素的秸桿等生物質(zhì)大規(guī)模高效低成本地發(fā)酵轉(zhuǎn)化為燃料乙醇、甲烷或氫氣等清潔能源是目前國(guó)際上的一大熱點(diǎn)課題。目前美國(guó)麻省理工學(xué)院、密歇根州立大學(xué)、加州大學(xué)Davis 分校、 杜邦公司和 Syngenta 公司等正在加緊開(kāi)展相關(guān)的研究探索，主要在玉米、甘蔗等植株 生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶，以獲得更有利于秸稈高效水解的農(nóng)作物，但至今很少見(jiàn)到公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo) [1]。作為一種有機(jī)金屬酶類，氫酶對(duì)氫代謝至關(guān)重要，研究其基因結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)、催化中心、電子載體種類和傳遞順序等具有很高的理論價(jià)值，深入發(fā)掘這 些生物信息對(duì)于人們定向改進(jìn)氫酶性能，獲得高產(chǎn)氫菌種具有指導(dǎo)意義。 Mishra[2]等分離出高產(chǎn)氫菌陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae IIT BT08 的氫酶基因進(jìn)而進(jìn)行了酶分子特性研究。梭菌的鐵氫酶已經(jīng)成功的 克隆，并異源表達(dá)到光合細(xì)菌內(nèi)，強(qiáng)化了光合菌的產(chǎn)氫過(guò)程。無(wú)論是純種還是混菌培養(yǎng)，提高關(guān)鍵菌株產(chǎn)氫效率都是最重要的工作。由于產(chǎn)氫細(xì)菌內(nèi)的氫酶種類繁多，通過(guò)敲掉基因片段的方法是一個(gè)可行策略。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段對(duì)氫酶進(jìn)行強(qiáng)化，包括增加其活性、耐氧性也都是可行策略。 有報(bào)道 對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行激光誘變，篩選得到一株能夠耐受 的高產(chǎn)氫突變株，產(chǎn)氫量較出發(fā)菌提高了 48％[4]。 此外，也可 將產(chǎn)氫能力高的菌株的氫化酶植入一些雖然不產(chǎn)氫但是對(duì)環(huán)境耐受力高 （如酸堿度、溫度、底物濃度） 的菌株，如在非產(chǎn)氫菌 Escherichia coli 中植入丁酸梭菌的氫化酶，產(chǎn)氫量可達(dá)到 糖，高于原丁酸梭菌 [6]。 Jonathan Wood Ward[7] 用 10 種商業(yè)用酶使戊糖磷酸鹽循 環(huán)與氫酶產(chǎn)氫過(guò)程相耦合，使產(chǎn)氫達(dá)到 ／ mol 葡萄糖，充分展示了人工構(gòu)建代謝途徑對(duì)于產(chǎn)氫的巨大潛力。通過(guò)細(xì)菌的代謝工程改造和控制，將會(huì)是突破暗發(fā)酵制氫低轉(zhuǎn)化率的重要突破口。其中 NADH 途徑是最具開(kāi)發(fā)潛力的方向， 多篇文獻(xiàn)中提到提高 NADH 的含量是有利于產(chǎn)氫的 。核心問(wèn)題是如何把細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量 NADH，通過(guò)代謝途徑的導(dǎo)向直接為氫酶提供還原力進(jìn)行產(chǎn)氫。 經(jīng)檢索表明，國(guó)內(nèi)外關(guān)于在轉(zhuǎn)基因水稻秸桿中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶促進(jìn)其高效水解的相關(guān)專利尚未見(jiàn)到，關(guān)于在產(chǎn)氣腸桿菌中 剔除乳酸等不 利于產(chǎn)氫的基因片段并且導(dǎo)入 產(chǎn)氫酶 [Fe]hydrogenase 基因片段的 相關(guān)專利也沒(méi)有見(jiàn)到 。 日本專利 JP62134091 [11] 將一種在 檸檬酸細(xì)菌的 染色體DNA 上表達(dá)的 氫化酶基因 植入普通的 DNA 單元質(zhì)粒，從而形成一種混合的 DNA 質(zhì)粒能使產(chǎn)氫能力顯著提高。 美國(guó)專利僅有一篇關(guān)于改造藻類基因強(qiáng)化其光合作用產(chǎn)氫的報(bào)道，中國(guó)專利主要集中于氫 酶的鑒定和基因測(cè)序，美國(guó)和中國(guó)專利都 沒(méi)有關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌基因改造方面的報(bào)道。 from laboratory to outdoor culture. International Journal of Hydrogen Energy,2020,27:12711281. [4] Lu WY. Wen JP. Jia al. Effect of HeNe laser irradiation on hydrogen production by Enterobacter aerogenes. International Journal of Hydrogen Energy (in press). [5] 鄭國(guó)香，任南琪，林海龍等 . 誘變菌種選育高效產(chǎn)氫 菌株 . 第六屆全國(guó)氫能學(xué)術(shù)會(huì)議論文集 . 2020； 11： 137. [6] G. Chittibabu, Kaushik Nath, Debabrata Das. Feasibility studies on the fermentative hydrogen production by rebinant Escherichia coli BL21. Process Biochemistry 41 (2020) 682–688 [7] H Yokoi, T Tokushige, J Hirose, et al. H2 production from starch by a mixed culture of Clostridium butyricum and Enterobacter oerogenes. Biotechnology Letters, 1998, 20: 143147. [8] Tanisho S, Ishiwata Y, Takahashi K. Hydrogen production by fermentation and a trial for improment on the yield of hydrogen, Hydrogen energy Progress. Proceedings of the Ninth World Hydrogen Energy conference. 1992:583590. [9] Tanishio S, in Biohydrogen,ed, O R Zaborsky. 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