【正文】 細(xì)胞中，以及其在sf9 細(xì)胞中的穩(wěn)定性，我們采用 mCherry 紅色熒光蛋白基因作為報告基因。特別是當(dāng)我們的目的蛋白是作為功能蛋白時，此時對該蛋白的實時表達(dá)控制，即是對一個代謝通路的調(diào)節(jié)與控制。前者在某種程度上更加類似于化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)，至于化學(xué)誘導(dǎo)啟動子和光誘導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)劣比較，前面已有詳述，此處不再贅述。 當(dāng)前應(yīng)用較廣的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)使用較為成熟，它的優(yōu)點(diǎn)已有目共矚。也切掉了 OpIE2啟動子，詳細(xì)構(gòu)建步驟后面會說明。初始載體圖譜（圖 2.）。該載體主要用于帥選被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及用于在鱗翅類昆蟲細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。（ b）轉(zhuǎn)染 pC120mCherry后的293T野生型細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá) VPEL222蛋白的細(xì)胞在光照黑暗兩種條件處理后的熒光顯微鏡下的圖像。 圖 293T細(xì)胞中的表現(xiàn)。對比光照和黑暗， VPEL222 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)入與否，從圖中可以很清晰地看到 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中工作效率很高。 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中的表現(xiàn) 此系統(tǒng)由 Laura B MottaMena等最先從 293T細(xì)胞中發(fā)展而來 14，在推廣該系統(tǒng)前，已經(jīng)做了大量的驗證實驗。最后，在斑馬魚中已證明不論是全身還是組織特異性的基因都適用利用 EL222 來實現(xiàn)最低毒性的光控表達(dá)，擴(kuò)大了這個表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 4 圍。這個系統(tǒng)有快速的激活（ 10s）和去激活能力（ 50s），這與另一種同樣以LOV 為基礎(chǔ)的光控系統(tǒng)形成鮮明對比，該系統(tǒng)的去激活能力 小于 2 小時。通過這個方法，在 293T細(xì)胞中應(yīng)用這個系統(tǒng)已被證明了富集倍數(shù)超過 200 的過表達(dá)。在這里我們將報告一個經(jīng)過基因工程改造的 EL222。在 EL222 原始宿主中，發(fā)現(xiàn)這個基因的光依賴激活作用與基因組上的 EL222結(jié)合位點(diǎn)毗鄰， 暗示這個蛋白質(zhì)是一個光敏轉(zhuǎn)錄因子。藍(lán)光照射會觸發(fā)光化學(xué)反應(yīng)： LOV 結(jié)構(gòu)域中的黃素蛋白復(fù)合物打斷了 LOV 和HTH 的相互作用，使 EL222 二聚化，從而發(fā)揮 DNA 結(jié)合蛋白活性 12， 13。 這個系統(tǒng)的光依賴轉(zhuǎn)錄激活作 用只需少量元件，一個光敏結(jié)構(gòu)域 LOV11，一個螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋（ HTH） DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過這個系統(tǒng)，已在多種哺乳動物細(xì)胞中測試了光控轉(zhuǎn)錄作用。 7， 8， 9 VPEL222轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng) EL222 轉(zhuǎn)錄因子，最初源于一個細(xì)菌的光 氧 壓蛋白 10，被藍(lán)光照射時就會二聚化結(jié)合到 DNA 上。本文將講述的一個光控表達(dá)系統(tǒng)一定程度上相對 其它光控系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。當(dāng)前已被開發(fā)出來的光控啟動子華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 3 大多有一個共同的缺點(diǎn)：對目標(biāo)基因表達(dá)量的調(diào)控范圍較窄。另外，對于精確度的掌握，光的劑量控制顯然比化學(xué)物質(zhì)的劑量控制更方便也更科學(xué)。首先是敏捷度高，從接受刺激到產(chǎn)生效果只需要很短的時間，而當(dāng)誘導(dǎo)物是其它物質(zhì)時，從接受刺激到產(chǎn)生效果很大程度上受限于化學(xué)分子的擴(kuò)散速率，而擴(kuò)散速率由于很多其它因素有關(guān)，諸如溫度、分子大小等，這些因素的存在使得實驗條件不易精確 控制。 光控啟動子，由于其在時間和空間上對基因表達(dá)高精度的控制性而很受很多領(lǐng)域研究的歡迎。 光誘導(dǎo)啟動子 人工誘導(dǎo) 型還有一顆新星，光誘導(dǎo)表達(dá)啟動子，簡稱光控啟動子。 2）激活型啟動子系統(tǒng) 在抑制型啟動子系統(tǒng)中，抑制基因轉(zhuǎn)錄所需誘導(dǎo)物的量往往超出植物適應(yīng)的范圍，而且在真核生物中激活基因比 抑制基因轉(zhuǎn)錄更容易，近年發(fā)展了一些激活型啟動子系統(tǒng)，如地塞米松誘導(dǎo)的 GR 系統(tǒng)、雌二醇誘導(dǎo)的 ER 系統(tǒng)、殺蟲劑誘導(dǎo)的 EcR 系統(tǒng)等。當(dāng)誘導(dǎo)物不存在時，激活蛋白與阻遏蛋白結(jié) 合，基因正常轉(zhuǎn)錄；添加誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)物與激活蛋白結(jié)合或阻止其與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白則與啟動子上的某些順式作用元件結(jié)合，抑制 基因轉(zhuǎn)錄，如以四環(huán)素抑制子為基礎(chǔ)的四環(huán)素抑制系統(tǒng) (tTA)。 人工誘導(dǎo)啟動子使人為控制基因表達(dá)成為可能。 一個理想的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)具備以下特點(diǎn)：首先，外源基因在植物體自身不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)添加誘導(dǎo) 物后，高效誘導(dǎo)基因表達(dá)；其次，誘導(dǎo)物需要有較強(qiáng)的專一性；第三，誘導(dǎo)物可快速啟動基因表達(dá)的“開”與“關(guān)”；而且誘導(dǎo)物對植物無毒 或低毒。自第一次用化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) TetR，通過 CaMV35S 啟動子成功調(diào)節(jié) cat基因的表達(dá)以來已有 20 多年的 歷史，現(xiàn)已發(fā)展成日臻完善的植物表達(dá)外源基因的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。人工構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以滿足不同需求。由于生物生長環(huán)境及基因表達(dá)的復(fù)雜性，從外界環(huán)境的刺激到啟動應(yīng)答基因的表達(dá)之間的信號通路往往是相互交 叉的，這樣啟動子中包含的順式作用元件通常也不止一種。長期進(jìn)化過程中，生物通過啟動不同 基因 的表達(dá)可在一定范圍內(nèi)適應(yīng)光、溫、水等環(huán)境的變化。 4) Able to acmodate large fragment exogenous gene. Currently existing experiment proves that this system play a role in 293 cells, and the result is very we plan to introduce it to the sf9 insect cells. Our main work is to build a carrying plasmid of the system, then to transfect sf9 cell, getting the data of the expression level of reporter gene . Before introducing this system we need to carry on the qualitative test, mCherry gene which is a red fluorescent protein gene is made to be the reporter gene, through the expression of which we can learn the effect of the optogeic gene expression system in sf9 cell. This paper is mainly about the exploration of the system . As a manual control gene expression system,this system is one of the most promising system of the the grate advantages , it is expected to play a role in basic life science field, and the application of it here is only a small application is never limited to the insect cells, also functional in many vertebrates cell. This assay to apply the system in sf9 cells is the first time in the word. Keywords: Baculovirus Expression Vector, Optical expression system, insect cells . 縮略詞表 Amp Ampicillin 氨芐青霉素 LB LuriaBertani culture medium LB 培養(yǎng)基 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 PCR polymerase chain reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) GFP Green Fluorescent Protein 綠色熒光蛋白 BEV Baculovirus Expression Vector 桿狀病毒表達(dá)載體 SNP Single Nucleotide Polymorphisms 單核苷酸的多態(tài)性 SM Streptomycin 鏈霉素 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 1 1 前言 誘導(dǎo)型啟動子 天然誘導(dǎo)型啟動子 (inducible promoter)是指自然界天然存在的在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，該 種類型的啟動子可以大幅度地提高 基因 的轉(zhuǎn)錄水平。 2) Able to be modified after translation processing ,including: glycosylation, phosphorylation, amidation and signal peptide cutting etc., to make the rebinant protein more close to natural protein on the structure and function。 關(guān)鍵詞：桿狀病毒表達(dá)載體、光控表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞 。 這個系統(tǒng)作為人工控制基因表達(dá)系統(tǒng)家族中的最有潛力的系統(tǒng)之一，具有足夠的優(yōu)勢，有望在生命科學(xué)各個領(lǐng)域發(fā)揮作用，這里對它的應(yīng)用只是一個很小的方面，它本身的應(yīng)用并不僅限于昆蟲細(xì)胞，對很多脊椎動物細(xì)胞都適用。 在引入這個系統(tǒng)之前我們需要對其進(jìn)行定性測試，采取的 方法是用紅色熒光蛋白基因 mCherry作為報告基因，通過 mCherry的表達(dá)情況大致了解這個光控系統(tǒng)的運(yùn)作行為。 該系統(tǒng)當(dāng)前已有實驗證明在 293細(xì)胞中發(fā)揮作用，且效果良好，我們計劃把它引入到 sf9昆蟲細(xì)胞中。因此從某種程度上說，桿狀病毒表達(dá)載體所具有的優(yōu)點(diǎn)，我們使用的 pMIB載體也同樣具有。盡管如此，這兩個啟動子仍然能夠在 sf9細(xì)胞、 sf2 LD652Y等多種昆蟲細(xì)胞中驅(qū)動基因表達(dá)。 而我們用 來構(gòu)建的這個光控表達(dá)系統(tǒng)所使用的載體 pMIB/v5his中的 OpIE1和 OpIE2正是一個桿狀病毒的早期啟動子，其中后者是比前者更強(qiáng)的啟動子。桿狀病毒是一類以昆蟲細(xì)胞為天然宿主的雙鏈 DNA病毒，具有高度的種屬特異性，不感染脊椎動物，對人畜無害。 Sf9昆蟲細(xì)胞是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的平臺。 IPLBSF 21 AE是 1977年由 Vaughn等從草地夜蛾蛹的卵巢組織得到 的。 Sf9昆蟲細(xì)胞即草地貪夜蛾細(xì)胞。這一方法對在時空上精確控制基因表達(dá)是一個強(qiáng)大的工具。在我們這里將展示一個新的光控表達(dá)系統(tǒng)，它沒有前述三大缺點(diǎn)，且已被證明廣泛的適用性。光作為誘導(dǎo)因子控制基因表達(dá)比其它化學(xué)因子具有無可比擬的優(yōu)勢，如對時間和空間上的精確把握。 本科畢業(yè)論文 (設(shè)計 ) 題 目 基于 sf9昆蟲 細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 Construction of Bluray Induced Expression System in sf9 insect Cells 姓 名 蔡澤蘄 學(xué) 號 20xx30420xx07 學(xué) 院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 專業(yè)班級 生科 1101 指導(dǎo)教師 徐富強(qiáng) 職 稱 研究員 中國武漢 二〇一 五 年 六 月 華中農(nóng) 業(yè)大學(xué) 學(xué) 士學(xué)位論文 基于 sf9昆蟲 細(xì)胞的 藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建