【導(dǎo)讀】本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì)). 題目基于sf9昆蟲細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。姓名蔡澤蘄學(xué)號20xx30420xx07. 學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院專業(yè)班級生科1101. 指導(dǎo)教師徐富強(qiáng)職稱研究員。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)20xx屆本科畢業(yè)論文。質(zhì)粒抽提試劑盒的使用.......

　　

【正文】 ） pC120Fluc 和 pVPEL222 載體 9 信息 均來自參考文獻(xiàn) 9 中的 附加 信息 ， 由 該文章的作者實(shí)驗(yàn)室提供。 圖 。 本次實(shí)驗(yàn)需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒有兩個： pMIBC120mCherryGFPEL222（以下簡稱為①號）、 pMIBC120mCherryGFP（以下簡稱為②號）。 1） 使用標(biāo)準(zhǔn) 6 孔板傳代培養(yǎng) sf9 細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到每孔 8 105 時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備 10ml 平板培養(yǎng)基： Grace 細(xì)胞培養(yǎng)液（含 10％FBS） + Grace細(xì)胞培養(yǎng)液（不含 FBS）。平板培養(yǎng)基中不可有 抗生素 。 2） 放置待轉(zhuǎn)染的 sf9 細(xì)胞與超凈臺上 15min，吸除平板中的培養(yǎng)基，加入。 3） 稀釋 8μl轉(zhuǎn)染試劑（ Cellfectin174。 II Reagent）于 100μl Grace’s 培養(yǎng)基。稀釋 13μg目標(biāo)質(zhì)粒于 100μl Grace’s 培養(yǎng)基。 4） 將稀釋后的 DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，室溫孵育 1530min。 5） 加 210μl混合液于待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中， 28℃孵育 35h。 6） 吸除轉(zhuǎn)染試劑混合液，加入 2ml sf9 細(xì)胞完全培養(yǎng)液 （含雙抗及 10％FBS）， 28℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)， 24h 后跟蹤細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)不同需求，給予培養(yǎng)細(xì)胞不同的光照條件。 本次一共設(shè)計(jì)了四組轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染①號質(zhì)粒的光照與黑暗兩組，轉(zhuǎn)染②號質(zhì)粒的光照與黑暗兩組。藍(lán)光照射條件為：照射 10s、黑暗 10s 為一個循環(huán)。 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 12 3結(jié)果與分析 圖 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體和 pMIBC120mCherryGFP載體的酶切鑒定圖。圖中，中間條帶為 marker 條帶，從上到下依次代表： 8k、5k、 3k、 2k、 1k、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp。①號和②號分別為 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶；③號和④號分別為 pMIBC120mCherryGFP 載體的 AgeI/SpeI 和 BsiwI 的酶切條帶。鑒定結(jié)果符合預(yù)期，①號和③號 750bp 條帶為 mCherry帶，②號 900bp 左右條帶為EL222帶。送測序也符合預(yù)期。 圖 。 分別轉(zhuǎn)染 pMIBC120mCherryGFPEL222 質(zhì)粒（ 圖 5 中簡稱為①號質(zhì)粒）和 pMIBC120mCherryGFP 質(zhì)粒（圖 5 中簡稱為②號質(zhì)粒）于 sf9 細(xì)胞中， 28℃孵育 24h，再施與光照與黑暗兩種條件， 24h 和 48h 后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光分布情況（圖 5）。 1） ①號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后施與光照（藍(lán)光照射 10s停 10s為一個循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照 24小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(a)）。 2） ②號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，同樣設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后施與光照（藍(lán)光照射 10s 停 10s 為一 個循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照24小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(b)）。 3） ①號質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后施與光照（藍(lán)光照射 10s停 10s為一個循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照 48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(c)）。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 13 從圖 5(a)的數(shù)據(jù)可以看出，該系統(tǒng)在 sf9 細(xì)胞中能初步工作，不過其工作效率較低。首先在 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體轉(zhuǎn)染結(jié)果中看，轉(zhuǎn)染效率較高（有綠色熒光的細(xì)胞較多），不過其中有紅色熒光的細(xì)胞 較少。帶紅色熒光的細(xì)胞占帶色熒光細(xì)胞的比例較低，在沒有流式細(xì)胞儀的情況下，很難建立該系統(tǒng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。 從圖 5(c)中可以看出，藍(lán)光額外照射 24h 會略微增加紅色熒光細(xì)胞的數(shù)量，但增加不是很明顯。 圖 5(b)中， 沒有 EL222 的陰性對照和黑暗條件下的對照基本符合預(yù)期 ，泄露表達(dá)情況很微弱 。 初步分析，該系統(tǒng)工作效率低的原因可能 VPEL222 蛋白的表達(dá)并不如預(yù)期。實(shí)驗(yàn)中， EL222 和 GFP 屬于串聯(lián)表達(dá)，利用真核細(xì)胞中的核糖體泄漏掃描機(jī)制，通過 2A 自剪切多肽在同一個啟動子的控制之下，表達(dá)時(shí)， VPEL222 后于 GFP 翻譯。因此可能是由于這一機(jī)制在 sf9 細(xì)胞中出現(xiàn)問題，或是其它相關(guān)原因?qū)е?VPEL222 的表達(dá)量不及預(yù)期，導(dǎo)致紅色熒光細(xì)胞占綠色熒光的細(xì)胞比例較低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將繼續(xù)摸索轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件，多做幾個重復(fù)，如果得到的結(jié)果沒有預(yù)期改善，則考慮換一種方式表達(dá) EL222 蛋白。如使用其它的組成型啟動子。 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 14 另一個原因則可能是該光控表達(dá)系統(tǒng)本身不適合在 sf9 細(xì)胞中工作。當(dāng)采用 western blot 實(shí)驗(yàn)或其它分子生物學(xué)方法證實(shí) EL222 蛋白的表達(dá)量足夠時(shí)，這一猜想將被證實(shí)。 雖然該系統(tǒng)在 sf9細(xì)胞中的初次實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)不 是很理想，但此次實(shí)驗(yàn)的一個重大成果是證明了 VPEL222光控表達(dá)系統(tǒng)能夠在 sf9昆蟲細(xì)胞中工作（即是工作效率不高，仍具有借鑒意義）。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 15 參考文獻(xiàn) 1 Weber, W. amp。 Fussenegger, M. Inducible product gene expression technology tailored to bioprocess engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 399– 410 (20xx). 2 Weber, W. amp。 Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat. Rev. Ge. 13, 21– 35 (20xx). 3 Briggs, . amp。 Spudich, . Handbook of Photosensory Receptors (WileyVCH, 20xx). 4 Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S. amp。 Lin, C. Optogeic control of transcription in zebrafish. PLoS ONE 7, e50738 (20xx). 5 Wang, X., Chen, X. amp。 Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a lightswitchable transgene system. Nat. Methods 9, 266– 269 (20xx). 6 Polstein, . amp。 Gersbach, . Lightinducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480– 16483 (20xx). 7 ShimizuSato, S., Huq, E., Tepperman, . amp。 Quail, . A lightswitchable gene promoter system. Nat. Biotechnol. 20, 1041– 1044 (20xx). 8 Levskaya, A. et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature 438, 441– 442 (20xx) 9 Yazawa, M., Sadaghiani, ., Hsueh, B. amp。 Dolmetsch, . Induction of proteinprotein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941– 945 (20xx). 10 Nash, . et al. Structural basis of photosensitivity in a bacterial lightoxygenvoltage/helixturnhelix (LOVHTH) DNAbinding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 9449– 9454 (20xx). 11 1Huala, E. et al. Arabidopsis NPH1— a protein kinase with a putative redoxsensing domain. Science 278, 2120– 2123 (1997). 12 RiveraCancel, G., MottaMena, . amp。 Gardner, . Identification of natural and artificial DNA substrates for lightactivated LOVHTH transcription factor EL222. Biochemistry 51, 10024– 10034 (20xx). 13 Zoltowski, ., MottaMena, . amp。 Gardner, . Blue light– induced dimerization of a bacterial LOVHTH DNAbinding protein. Biochemistry 52, 6653– 6661 (20xx). 14 Laura B MottaMena,Anna Reade,Michael J Mallory,Spencer optogeic gene expression system with rapid activation and deactivation kiics. Nature chemical biology,10,196202(20xx) 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 17 致 謝 本研究是在導(dǎo)師徐富強(qiáng)研究員和博士后師兄吳陽的悉心指導(dǎo)下完成的。感謝徐富強(qiáng)老師和何曉斌老師給我進(jìn)入生物磁共振實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)的機(jī)會。在課題的選題、實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和論文的撰寫上傾注了大量的心血，感激之情難以言盡；師兄淵博的學(xué)識、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度、忘我投入的工作作風(fēng)和平易近人的人格魅力都深深的感染和激勵著我。除了在科研上的嚴(yán)格要求，他們在日常的生活和學(xué)習(xí)上也給予了極大 的關(guān)心和無私的幫助。再次向徐老師、何老師、吳師兄表達(dá)最真摯的感謝！ 剛剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，得到了王華東師兄、賈凡師兄、阮世龍師兄、林坤章師兄、高娟師姐、丁婷師姐等在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的耐心指導(dǎo)；幾個月的相處，從與師兄師姐們的交流中獲益匪淺，在此，我向他們表達(dá)最誠摯的謝意。 焉得諼草，言樹之背。養(yǎng)育之恩，無以回報(bào)，感謝父母給與我學(xué)業(yè)的大力支持，他們的理解與支持是我勇于追求、不斷前進(jìn)的源泉和動力，使我能夠全心投入工作，完成學(xué)業(yè)。 衷心感謝所有關(guān)心我、支持我和幫助我的人。 蔡澤蘄 20xx年 5月 22日