【文章內容簡介】 mall application is never limited to the insect cells, also functional in many vertebrates cell. This assay to apply the system in sf9 cells is the first time in the word. Keywords: Baculovirus Expression Vector, Optical expression system, insect cells . 縮略詞表 Amp Ampicillin 氨芐青霉素 LB LuriaBertani culture medium LB 培養(yǎng)基 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 PCR polymerase chain reaction 聚合酶鏈式反應 GFP Green Fluorescent Protein 綠色熒光蛋白 BEV Baculovirus Expression Vector 桿狀病毒表達載體 SNP Single Nucleotide Polymorphisms 單核苷酸的多態(tài)性 SM Streptomycin 鏈霉素 華中農業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 1 1 前言 誘導型啟動子 天然誘導型啟動子 (inducible promoter)是指自然界天然存在的在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該 種類型的啟動子可以大幅度地提高 基因 的轉錄水平。目前已經分離了光誘導表達 基因 啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等。長期進化過程中，生物通過啟動不同 基因 的表達可在一定范圍內適應光、溫、水等環(huán)境的變化。這些 基因 的啟動子通常包含比較保守的 順式作用元件 ，利用這些保守元件可以推 測新基因的可能功能，也可用這些環(huán)境應答基因的啟動子與抗逆 基因融合 ，從而使轉基因生物更好地適應逆境。由于生物生長環(huán)境及基因表達的復雜性，從外界環(huán)境的刺激到啟動應答基因的表達之間的信號通路往往是相互交 叉的，這樣啟動子中包含的順式作用元件通常也不止一種。 在開發(fā)植物天然存在的誘導型啟動子的基礎上。人工構建可誘導表達系統(tǒng)以滿足不同需求。目前研究最多、最深 入的可誘導表達系統(tǒng)是化學誘導表達系統(tǒng)。自第一次用化學誘導表達系統(tǒng) TetR，通過 CaMV35S 啟動子成功調節(jié) cat基因的表達以來已有 20 多年的 歷史，現已發(fā)展成日臻完善的植物表達外源基因的可誘導表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括兩個轉錄單元：一是與化學誘導物結合的轉錄因子的表達，另 一個轉錄單元包含一個應答元件，經誘導物處理后，通過它激活轉錄因子，從而激活或抑制目的基因的表達。 一個理想的化學誘導表達系統(tǒng)應具備以下特點：首先，外源基因在植物體自身不表達或低水平表達，當添加誘導 物后，高效誘導基因表達；其次，誘導物需要有較強的專一性；第三，誘導物可快速啟動基因表達的“開”與“關”；而且誘導物對植物無毒 或低毒。根據控制基因表達的方式，可將化學誘導系統(tǒng)分 為兩大類：阻遏型啟動子系統(tǒng)和激活型啟動子系統(tǒng)。 人工誘導啟動子使人為控制基因表達成為可能。 1， 2 基 于 sf9細胞的藍光誘導表達系統(tǒng)的構建 2 1）阻遏型啟動子系統(tǒng) 該系統(tǒng)建立在阻遏蛋白與轉錄因子在空間構型相互作用的基礎之上。當誘導物不存在時，激活蛋白與阻遏蛋白結 合，基因正常轉錄；添加誘導物后，誘導物與激活蛋白結合或阻止其與阻遏蛋白結合，阻遏蛋白則與啟動子上的某些順式作用元件結合，抑制 基因轉錄，如以四環(huán)素抑制子為基礎的四環(huán)素抑制系統(tǒng) (tTA)。 Love 等用包含四環(huán)素抑制子的啟動子 Topl0 與報告基因 GFP 相連轉化擬南芥，發(fā)現 用 100 ng/mL 的四環(huán)素即可抑制 GFP 的表達，而且改變培養(yǎng)基中四環(huán)素的濃度，可調節(jié) GFP的表達水平。 2）激活型啟動子系統(tǒng) 在抑制型啟動子系統(tǒng)中，抑制基因轉錄所需誘導物的量往往超出植物適應的范圍，而且在真核生物中激活基因比 抑制基因轉錄更容易，近年發(fā)展了一些激活型啟動子系統(tǒng)，如地塞米松誘導的 GR 系統(tǒng)、雌二醇誘導的 ER 系統(tǒng)、殺蟲劑誘導的 EcR 系統(tǒng)等。激活型 啟動子系統(tǒng)的優(yōu)點是只有當誘導物存在時才能啟動基因表達，去除誘導物后，基因表達很快被關閉，這樣就可以人為地精確、快速控制基因的表達。 光誘導啟動子 人工誘導 型還有一顆新星，光誘導表達啟動子，簡稱光控啟動子。 光控表達系統(tǒng)可以在空間和時間上精確控制轉錄，這和很多傳統(tǒng)的誘導表達啟動子不一樣 3。 光控啟動子，由于其在時間和空間上對基因表達高精度的控制性而很受很多領域研究的歡迎。光作為光控啟動子的誘導因子，具有其它各種誘導型啟動子誘導條件無與倫比的優(yōu)勢。首先是敏捷度高，從接受刺激到產生效果只需要很短的時間，而當誘導物是其它物質時，從接受刺激到產生效果很大程度上受限于化學分子的擴散速率，而擴散速率由于很多其它因素有關，諸如溫度、分子大小等，這些因素的存在使得實驗條件不易精確 控制。再者光在某種程度上是完全無毒的 對細胞中其它的生化反應無任何影響的條件，這是非光誘導因子所不能做到的，光的激活和去激活作用完成一個循環(huán)后在細胞中可以做到零殘留，這使得實驗條件控制更加理想化，少了一個不可控的變量 5， 6。另外，對于精確度的掌握，光的劑量控制顯然比化學物質的劑量控制更方便也更科學。對于精度要求高的生物實驗很是適合的。當前已被開發(fā)出來的光控啟動子華中農業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 3 大多有一個共同的缺點：對目標基因表達量的調控范圍較窄。如能在此方面有重大突破，將帶來光遺傳學的一場革命。本文將講述的一個光控表達系統(tǒng)一定程度上相對 其它光控系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。光誘導啟動子一般都會依賴于一個光敏轉錄因子，而這類光敏轉錄因子大多是通過人工改造光敏蛋白得到。 7， 8， 9 VPEL222轉錄激活系統(tǒng) EL222 轉錄因子，最初源于一個細菌的光 氧 壓蛋白 10，被藍光照射時就會二聚化結合到 DNA 上。這個系統(tǒng)對控制表達的目標蛋白有足夠大的的可調表達范圍，敏捷的激活和去激活作用，以及對光強足夠高的線性相關性。通過這個系統(tǒng)，已在多種哺乳動物細胞中測試了光控轉錄作用。這一方法對在時空上精確控制基因表達是一個強大的工具。 這個系統(tǒng)的光依賴轉錄激活作 用只需少量元件，一個光敏結構域 LOV11，一個螺旋 轉角 螺旋（ HTH） DNA 結合結構域。黑暗時 LOV 結構域結合者HTH 結構域，覆蓋了對于成為二聚體而結合到 DNA 所必需的 HTH4α位點。藍光照射會觸發(fā)光化學反應： LOV 結構域中的黃素蛋白復合物打斷了 LOV 和HTH 的相互作用，使 EL222 二聚化，從而發(fā)揮 DNA 結合蛋白活性 12， 13。這些反應在黑暗中又會反過來進行，其逆反應在停止藍光照射后將很快發(fā)生，這是快速去激活作用的基礎。在 EL222 原始宿主中，發(fā)現這個基因的光依賴激活作用與基因組上的 EL222結合位點毗鄰， 暗示這個蛋白質是一個光敏轉錄因子。 對 EL222 機制的理解使我們能夠在單一蛋白質復合系統(tǒng)中使用光依賴基因激活作用。在這里我們將報告一個經過基因工程改造的 EL222。在接收適當藍光照射條件下，能在不同真核表達系統(tǒng)中激活轉錄。通過這個方法，在 293T細胞中應用這個系統(tǒng)已被證明了富集倍數超過 200 的過表達。與之對照，在最小泄露的非誘導條件下，黑暗條件和紅光照射富集倍數只能有小于 2 的改變。這個系統(tǒng)有快速的激活（ 10s）和去激活能力（ 50s），這與另一種同樣以LOV 為基礎的光控系統(tǒng)形成鮮明對比，該系統(tǒng)的去激活能力 小于 2 小時。而且，這個系統(tǒng)可以實現對細胞進程的功能性調節(jié)，因為已經證明光控調節(jié) 293T細胞的剪切作用。最后，在斑馬魚中已證明不論是全身還是組織特異性的基因都適用利用 EL222 來實現最低毒性的光控表達，擴大了這個表達系統(tǒng)的應用范基 于 sf9細胞的藍光誘導表達系統(tǒng)的構建 4 圍?？傊颜莆盏馁Y料和數據突出了 EL222 系統(tǒng)寬廣的通用性以及它作為光遺傳學工具的優(yōu)勢。 VPEL222系統(tǒng)在 293T細胞中的表現 此系統(tǒng)由 Laura B MottaMena等最先從 293T細胞中發(fā)展而來 14，在推廣該系統(tǒng)前，已經做了大量的驗證實驗。對于圖 1，左側是轉染后 的實時數據，右側是獲得穩(wěn)定細胞系后的數據。對比光照和黑暗， VPEL222 系統(tǒng)的轉入與否，從圖中可以很清晰地看到 VPEL222系統(tǒng)在 293T細胞中工作效率很高。該實驗中使用的報告基因是螢火蟲熒光素酶基因，通過該酶的活性測定獲得該基因的表達活性 14。 圖 293T細胞中的表現。（ a）四組細胞均被轉染 pC120Fluc，第一組細胞轉染空的不含 VPEL222的質粒，第二組轉染含 VPEL222的質粒（ pVPEL222），第 三組細胞為 293T野生型，第四組細胞為轉染 pVPEL222后獲得穩(wěn)定表達VPEL222細胞系，四個組各自分光照和黑暗兩小組。（ b）轉染 pC120mCherry后的293T野生型細胞和穩(wěn)定表達 VPEL222蛋白的細胞在光照黑暗兩種條件處理后的熒光顯微鏡下的圖像。 華中農業(yè)大學 20xx屆本科畢業(yè)論文 5 pMIB/V5His載體 pMIB/V5His 載體分 A、 B、 C 三型，這次實驗中使用的是 A 型，從Invitrogen公司購買。該載體主要用于帥選被轉染的細胞，以及用于在鱗翅類昆蟲細胞系中穩(wěn)定表達外源蛋白。原始載體全長約 ， ori來自 pUC 質粒，還有用于在大腸桿菌中篩選的氨芐青霉素（ AMP）抗性基因和在昆蟲細胞中篩選的殺稻瘟菌素（ Blasticidin）抗性。初始載體圖譜（圖 2.）。該載體通常只用于在昆蟲細胞中表達外源蛋白，在其上的多克隆位點中可以很容易插入一段外源序列，而此次我們需要其表達三個外源蛋白： mCherry 紅色熒光蛋白、 EL222轉錄因子、 GFP 綠色熒光蛋白，所以，我們采取讓后兩者串聯(lián)表達的方案（使用 2A自剪切多肽）。也切掉了 OpIE2啟動子，詳細構建步驟后面會說明。 圖 。 當前應用較廣的桿狀病毒表達系統(tǒng)已經使用較為成熟，它的優(yōu)點已有目共矚。但用作某些特定需求的基礎研究則會顯得力不從心，如當需要對目標蛋白進行實時控制時。前者在某種程度上更加類似于化學誘導系統(tǒng)，至于化學誘導啟動子和光誘導系統(tǒng)的優(yōu)劣比較，前面已有詳述，此處不再贅述。在 sf9 昆蟲細胞中建立一個光誘導表達系統(tǒng)，并獲得穩(wěn)定表達細胞系，將使對目標蛋白表達的調控更加靈活。特別是當我們的目的蛋白是作為功能蛋白時，此時對該蛋白的實時表達控制，即是對一個代謝通路的調節(jié)與控制。本實驗中在 sf9 細胞中建立的光控表達系 統(tǒng)，已有報道在 293T 細胞中實驗成功，也可以說，這個系統(tǒng)是最初從 293T 細胞中建立起來的 14，我們所做的工作是把該系統(tǒng)移植到基 于 sf9細胞的藍光誘導表達系統(tǒng)的構建 6 sf9 細胞中來。首先我們需要測試該系統(tǒng)是否能移植到 sf9 細胞中，以及其在sf9 細胞中的穩(wěn)定性，我們采用 mCherry 紅色熒光蛋白基因作為報告基因。通過分析，定性得到該光控系統(tǒng)的調節(jié)能力。因此這篇文章作為先導文章，通篇并不涉及該光控表達系統(tǒng)的實際應用，只是為后面能深入應用該系統(tǒng)做鋪墊。 實驗材料 材料與試劑 pMIB/v5hi