【正文】 衷心感謝所有關(guān)心我、支持我和幫助我的人。除了在科研上的嚴(yán)格要求，他們?cè)谌粘５纳詈蛯W(xué)習(xí)上也給予了極大 的關(guān)心和無(wú)私的幫助。 Gardner, . Identification of natural and artificial DNA substrates for lightactivated LOVHTH transcription factor EL222. Biochemistry 51, 10024– 10034 (20xx). 13 Zoltowski, ., MottaMena, . amp。 Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a lightswitchable transgene system. Nat. Methods 9, 266– 269 (20xx). 6 Polstein, . amp。 Fussenegger, M. Inducible product gene expression technology tailored to bioprocess engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 399– 410 (20xx). 2 Weber, W. amp。 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 14 另一個(gè)原因則可能是該光控表達(dá)系統(tǒng)本身不適合在 sf9 細(xì)胞中工作。實(shí)驗(yàn)中， EL222 和 GFP 屬于串聯(lián)表達(dá)，利用真核細(xì)胞中的核糖體泄漏掃描機(jī)制，通過(guò) 2A 自剪切多肽在同一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，表達(dá)時(shí)， VPEL222 后于 GFP 翻譯。帶紅色熒光的細(xì)胞占帶色熒光細(xì)胞的比例較低，在沒有流式細(xì)胞儀的情況下，很難建立該系統(tǒng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。 2） ②號(hào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 sf9 后，同樣設(shè)置藍(lán)光照射與黑暗條件培養(yǎng)兩組，轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后施與光照（藍(lán)光照射 10s 停 10s 為一 個(gè)循環(huán)）與黑暗兩種條件，光照24小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察，得到結(jié)果（圖 5(b)）。送測(cè)序也符合預(yù)期。 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 12 3結(jié)果與分析 圖 pMIBC120mCherryGFPEL222 載體和 pMIBC120mCherryGFP載體的酶切鑒定圖。 6） 吸除轉(zhuǎn)染試劑混合液，加入 2ml sf9 細(xì)胞完全培養(yǎng)液 （含雙抗及 10％FBS）， 28℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)， 24h 后跟蹤細(xì)胞狀態(tài)。 II Reagent）于 100μl Grace’s 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備 10ml 平板培養(yǎng)基： Grace 細(xì)胞培養(yǎng)液（含 10％FBS） + Grace細(xì)胞培養(yǎng)液（不含 FBS）。 3） pC120Fluc 和 pVPEL222 載體 9 信息 均來(lái)自參考文獻(xiàn) 9 中的 附加 信息 ， 由 該文章的作者實(shí)驗(yàn)室提供。⑤克隆方法同上，使用的酶切位點(diǎn)為 PvuII 和 BglII。②方法同上，使用限制性內(nèi)切酶為 BspHI 和 SpeI。重復(fù)一次； 9） 空轉(zhuǎn)， 14000g 離心 2min； 10） 加入適量的 ddH2O 洗脫，并測(cè)定濃度。 主要步驟如下： 1） 取 2mL 活化的菌液接種至 200 mL 的 LB 培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床， 37℃ 210rpm 培養(yǎng) 4 小時(shí)左右； 2） 將菌液分裝至 50 ml 離心管，冰上靜置 30 min，再 5000 rpm 離心 5 min 以沉淀菌體； 3） 用 5 mlTSS 緩沖液將細(xì)胞沉淀重懸浮，冰浴 30 min； 4） 分裝至預(yù)冷的 ml 的 EP 管中，每管 100 μ l，放至 80℃冰箱保存 。 注意：對(duì)于 PCR產(chǎn)物及 PCR片段的酶切產(chǎn)物的回收，直接加入 Binding Buffer 后，從第三步開始回收。去濾液，重復(fù)此步驟一次； 5） 空轉(zhuǎn)。將裝有膠塊的離心管短暫離心，依據(jù)刻度大致估算膠塊體積，加入等體積的 Binding Buffer 于 60℃溶膠，期間因上下顛倒離心管以加速溶膠； 3） 掛柱。 酶切體系和方法及膠回收試劑盒的使用 載體及片段酶切方法及體系： DNA量 酶 1 4u10u 酶 2 4u10u 10x Buffer 4μl ddH2O Total 40μl 酶切消化 2 小時(shí)后，對(duì)于載體先經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收對(duì)應(yīng)的大小的膠 帶，回收步驟如下： 1） 切膠。由第二步到第四步重復(fù) 30 個(gè)循環(huán)。 分子克隆基本策略 載體構(gòu)建的每一步均采用經(jīng)典的分子克隆方法： 1） 設(shè)計(jì)特異引物通過(guò) PCR擴(kuò)增獲得末端含有特定酶切位點(diǎn)的片段； 2） 同時(shí)對(duì)載體和片段分別酶切，并純化酶切產(chǎn)物； 3） 使用 T4 連接酶， 16℃連接載體片段過(guò)夜； 4） 轉(zhuǎn)化、搖菌、涂平板（實(shí)驗(yàn)中使用的都是氨芐抗性平板），平板于37℃烘箱中過(guò)夜； 5） 挑斑搖菌，菌體濃度增大后用相應(yīng)引物菌液 PCR鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)鑒定為陽(yáng)性的菌； 6） 保存菌種后（菌種保存在 10％ 15％甘油溶液中， 20℃），用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，并測(cè)定濃度 ； 7） 利用合理的限制酶對(duì)提到的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定； 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 8 8） 挑取陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序正確后將質(zhì)粒用于下一步使用。 20分鐘后膠塊凝固即可使用。 2） LB 固體培養(yǎng)基 將瓊脂粉加入至 LB 液體培養(yǎng)基中達(dá)到終濃度為 %即可， 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，倒平板前加入相應(yīng)抗生素 ，待凝固后 4 ℃保存?zhèn)溆?。通過(guò)分析，定性得到該光控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力。在 sf9 昆蟲細(xì)胞中建立一個(gè)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，將使對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)的調(diào)控更加靈活。 圖 。原始載體全長(zhǎng)約 ， ori來(lái)自 pUC 質(zhì)粒，還有用于在大腸桿菌中篩選的氨芐青霉素（ AMP）抗性基因和在昆蟲細(xì)胞中篩選的殺稻瘟菌素（ Blasticidin）抗性。（ a）四組細(xì)胞均被轉(zhuǎn)染 pC120Fluc，第一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空的不含 VPEL222的質(zhì)粒，第二組轉(zhuǎn)染含 VPEL222的質(zhì)粒（ pVPEL222），第 三組細(xì)胞為 293T野生型，第四組細(xì)胞為轉(zhuǎn)染 pVPEL222后獲得穩(wěn)定表達(dá)VPEL222細(xì)胞系，四個(gè)組各自分光照和黑暗兩小組。對(duì)于圖 1，左側(cè)是轉(zhuǎn)染后 的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，右側(cè)是獲得穩(wěn)定細(xì)胞系后的數(shù)據(jù)。而且，這個(gè)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的功能性調(diào)節(jié)，因?yàn)橐呀?jīng)證明光控調(diào)節(jié) 293T細(xì)胞的剪切作用。在接收適當(dāng)藍(lán)光照射條件下，能在不同真核表達(dá)系統(tǒng)中激活轉(zhuǎn)錄。這些反應(yīng)在黑暗中又會(huì)反過(guò)來(lái)進(jìn)行，其逆反應(yīng)在停止藍(lán)光照射后將很快發(fā)生，這是快速去激活作用的基礎(chǔ)。這一方法對(duì)在時(shí)空上精確控制基因表達(dá)是一個(gè)強(qiáng)大的工具。光誘導(dǎo)啟動(dòng)子一般都會(huì)依賴于一個(gè)光敏轉(zhuǎn)錄因子，而這類光敏轉(zhuǎn)錄因子大多是通過(guò)人工改造光敏蛋白得到。對(duì)于精度要求高的生物實(shí)驗(yàn)很是適合的。光作為光控啟動(dòng)子的誘導(dǎo)因子，具有其它各種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)條件無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。激活型 啟動(dòng)子系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)才能啟動(dòng)基因表達(dá)，去除誘導(dǎo)物后，基因表達(dá)很快被關(guān)閉，這樣就可以人為地精確、快速控制基因的表達(dá)。 1， 2 基 于 sf9細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 2 1）阻遏型啟動(dòng)子系統(tǒng) 該系統(tǒng)建立在阻遏蛋白與轉(zhuǎn)錄因子在空間構(gòu)型相互作用的基礎(chǔ)之上。該系統(tǒng)包括兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元：一是與化學(xué)誘導(dǎo)物結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，另 一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元包含一個(gè)應(yīng)答元件，經(jīng)誘導(dǎo)物處理后，通過(guò)它激活轉(zhuǎn)錄因子，從而激活或抑制目的基因的表達(dá)。 在開發(fā)植物天然存在的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上。目前已經(jīng)分離了光誘導(dǎo)表達(dá) 基因 啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 III Abstract As the most bright one of the artificial induced expression system, optogeic gene expression system is being more and more popular. Light as induced factor to control gene expression has the inparable advantages over other chemical factor, such as the accurate control of time and space. In spite of this, the current main optogeic gene expression system still has many weaknesses that limit its application, such as: the toxicity of the protein itself, narrow scope of regulation, and the slow activation and deactivation, so that it is not overwhelming pared with the traditional chemical inducing expression system . Here we will show a new optogeic gene expression system, which does not has the big three shortings, and has shown a wide range of applicability. With this system, we have tested in a variety of mammalian cells to confirm whether it can drive transcription of the target gene. The method for precise control of gene expression in time and space is a powerful tool. This paper will talk about the application of this new optogeic gene expression system in sf9 insect cell . Sf9 insect cells is Spodoptera frugiperda cell . Sf9 cells is made up of . Smith and . Cherry from cell lines IPLB in 1983 SF, a clone of the 21st AE to e. IPLB SF, 21st AE is 1977 by Vaughn from ovarian tissue of meadow moth pupa. Sf9 cells belong to half adherent cell lines, which can suspension culture, and also can undertake adherent ’s application in protein expression and the preparation and purification has many advantages over others. Sf9 insect cells is a p