【正文】 操作步驟（ 8） （ 10） 將吸附柱 CP3 放入收集管中， 12020rpm 離心 1min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。 （ 7） 向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 去蛋白液 PD， 12020rpm 離心 30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CP3 重新放回 收集管中。 （ 6） 將上一步收集的上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到吸附柱 CP3 中，盡量不要吸出沉淀。 （ 5） 向離心管中加入 350μ l 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 68 次，充分混勻，將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 （ 3） 向留有菌體沉淀的離心管中加入 250μ l 溶液 P1（使用前已加入 RNaseA） ,用移液槍徹底懸浮細(xì)菌沉淀。 操作步驟： （ 1） 柱平衡步驟：向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 平衡液 BL，倒掉收集管中的廢 16 液，將吸附柱重新放回收集管中。 PET28afasⅢ質(zhì)粒的少量制備 菌液保種：將選取的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，渾 濁后分別取 450μ l 菌液并各加入 50μ lDMSO 于 20℃凍存。 將無菌操作臺滅菌后，取 4 個(gè) 15mlEP 管，分別加入約 4ml 含卡那霉素（ Kan）的 LB 液體培養(yǎng)基。 挑菌落做菌落 PCR PCR 反應(yīng)體系 表 PCR 反應(yīng)體系 25μ l Table PCR reaction system(25μ l) 反應(yīng)組分 體積 10PCR Buffer l 15 dNTP l 上游引物 fasⅢ bamH/F l 下游引物 fasⅢ Hind/R l rTaq 酶 l 模板 ddH2O l 模板：陽性對照 — 重組質(zhì)粒的連接體系 陰性對照 — 無菌水 實(shí)驗(yàn)組 — 待檢測的菌落 PCR 反應(yīng)程序 97℃ 3min 94℃ 30s 30 cycles 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 3min 16℃ 3min 瓊脂糖凝膠電泳檢測：以 DNA Mamker 和陽性對照作參考，判斷實(shí)驗(yàn)組條帶大小是否正確，進(jìn)而判斷是否為陽性克隆。 DNA 片段的體外連接 (目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體 ) 配制連接體系，各成分如表 所示，體系中外源基因量要多些，載體的量要少些； 表 連接體系 10μ l Table Connection system(10μ l) 反應(yīng)組分 體積 10 T4 DNA ligase Buffer l T4 DNA ligase l 酶切的 PET28a 質(zhì)粒 l 酶切的 fasⅢ片段 l 混勻后用瞬時(shí)離心，使液體全部集中于管底； 將離心管放于 16℃ 水浴鍋保溫過夜； 取出連接體系，利用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 12020rpm 離心 2min 收集 DNA 溶液。將吸附柱 CA2 置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。 （ 5）將吸附柱 CA2 中加入 600μ l 漂洗液 PW， 12020rpm 離心 30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CA2 放入收集管中。 （ 3）向膠塊中加入 3 倍體積溶膠液 PN， 50℃水浴放置 10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。 瓊脂糖凝膠電泳法回收 DNA 制膠 切膠 瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒 操作步驟 （ 1）柱平衡步驟：向吸附柱 CA2 中加入 500μ l 平衡液 BL， 12020rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 5）干燥和溶解：自然干燥 5min 至殘留乙醇揮發(fā)干凈，加入 20μ L 無菌水溶解。 酶切 DNA 產(chǎn)物的純化 產(chǎn)物共 150μ L，集中到 EP 管，加無菌水至 500μ L （ 1）酚抽：在 EP 管中加入等體積，即 500μ L 苯酚 /氯仿混合液，顛倒混勻，室溫 12020r/min 離心 5min，吸取上層液到新的 EP 管，吸約 450μ L （ 2）加入 1/10 體積的 5M NaCl（按 450uL 換算，即 45μ L NaCl） 13 （ 3）加入 23 倍體積無水乙醇 1mL，混勻， 4℃ 12020r/min 離心 10min，吸走上清液，產(chǎn)物沉淀在底部。 （ 4）電泳：蓋好 電泳槽蓋子，接通電泳槽與電泳儀的電源，選擇電泳電壓 120V，開始電泳。 （ 2）膠板的制備： 1） 將塑料內(nèi)槽洗凈、晾干，放置于水平制膠器中，并放好樣品梳； 2） 待膠液冷到 60℃左右時(shí)，加入 2— 3μ l 的溴化乙錠，輕輕混勻后將膠液倒入塑料內(nèi)槽，至塑料板上形成一層膠面； 3） 待膠液凝固后，將梳子輕輕垂直拔出； 4） 將塑料內(nèi)槽取出放入電泳槽內(nèi)，并加入 1 TAE 緩沖液至電泳槽中使緩沖液浸沒膠面，高出凝膠。 引物片段： FasbamH/F： ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCG FasHind/R： ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG 質(zhì)粒載體 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體 PET28a 來自于本實(shí)驗(yàn)室保存。 細(xì)菌抗性原理： Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其 與核糖體結(jié)合作用。 抗菌素的抗性工作原理 卡那霉素（ kanamycin， Kan）殺菌原理： 通過與 70S 核糖體結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA 發(fā)生錯(cuò)讀。 （ 5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴(kuò)散，給人類造成危害。 （ 3） 具有多種單一的核酸酶切位點(diǎn) (多克隆位點(diǎn) )，可用于外源基因的插入，同時(shí)不影響載體的擴(kuò)增和繁殖。 基因工程對載體的要求： （ 1）具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。 載體 （ Vectors） 廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具叫載體。 fasⅢ 基因是蛋白編碼類基因，具有七個(gè)轉(zhuǎn)錄本，最早發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞中，功能是以 Ca2 +獨(dú)立的方式介導(dǎo)細(xì)胞粘附，在軸突發(fā)展、指導(dǎo)和束狀的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展發(fā)揮作用。 圖 12 精巢前端的結(jié)構(gòu) The leadingend structure of tesis fasⅢ基因 干細(xì)胞研究是目前國際研究前沿的熱點(diǎn)之一，生殖干細(xì)胞 GSC 的研究對于干細(xì)胞維 持與分化等領(lǐng)域，以及生殖醫(yī)學(xué)及其相關(guān)疾病等的治療都將提供有價(jià)值的資料。 Fusome 在 GB 中是圓形的，在分化的合胞體呈分支狀。同卵巢 GSCs 一樣 ,精巢的 GSCs 也通過不對稱分裂產(chǎn)生 2 個(gè)子代細(xì)胞，一個(gè) 仍然處于微環(huán)境中，與 HC 直接接觸，成為新的 GSC，另一個(gè)遠(yuǎn)離微環(huán)境，發(fā)育為 GB（ gonialblast） 細(xì)胞，走向分化。精巢里有兩類干細(xì)胞 :生殖干細(xì)胞 GSC 和體節(jié)干細(xì)胞 SSC。最終目的是實(shí)現(xiàn) fasⅢ 蛋白的原核表達(dá)與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。圖表整潔，布局合理 ，文字注釋必須使用工程字書寫，不準(zhǔn)用徒手畫 3）畢業(yè)論文須用 A4 單面打印，論文 50 頁以上的雙面打印 4）圖表應(yīng)繪制于無格子的頁面上 5）軟件工程類課題應(yīng)有程序清單，并提供電子文檔 1）設(shè)計(jì)（論文） 2）附件：按照任務(wù)書、開題報(bào)告、外文譯文、譯文原文（復(fù)印件）次序裝訂 指導(dǎo)教師評閱書 指導(dǎo)教師評價(jià)： 一、撰寫（設(shè)計(jì)）過程 學(xué)生在論文（設(shè)計(jì)）過程中的治學(xué)態(tài)度、工作精神 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生掌握專業(yè)知識、技能的扎實(shí)程度 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識和專業(yè)技能分析和解決問題的能力 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 研究方法的科學(xué)性；技術(shù)線路的可行性；設(shè)計(jì)方案的合理性 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 完成畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）期間的出勤情況 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量 論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是 否符合撰寫規(guī)范？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □