分離工程第八章ppt課件-文庫吧資料
2024-09-24 18:21本頁面
【正文】 ； pH梯度的穩(wěn)定性不高； 操作過程中發(fā)生凝膠脫水起皺現(xiàn)象。 ?在電泳設(shè)備中首先調(diào)配連續(xù)的 pH梯度，然后使蛋白質(zhì)在電場作用下泳動到各自等電點的 pH區(qū)域形成具有不同等電點的蛋白質(zhì)區(qū)帶。 一般都必須用已知相對分子量蛋白質(zhì)作為指示蛋白質(zhì) 、 與被測樣品在同一條件下進(jìn)行電泳 ， 給出 LgM –Rm曲線 ，求出樣品 Rm值對應(yīng)的 LgM ， 計算出被測樣品相對分子量 。 –因此，在樣品和凝膠中加入 SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與 SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì) SDS膠束， 所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異 ；同時， 蛋白質(zhì) SDS聚合體的形狀也基本相同 ，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也在 SDS作用下變的松散（蛋白質(zhì)變成多肽），形狀趨于一致，排除了電泳過程中電荷的影響，使SDS—聚丙烯酰胺電泳時，蛋白質(zhì)遷移率的差異僅是相對分子質(zhì)量的函數(shù)。 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 主要用于測定蛋白質(zhì) 亞基分子量 以及未知蛋白質(zhì)分子量的測定； ? 特點：設(shè)備簡單、操作簡便、測定快速、重復(fù)性高、樣品無需純化。 ? 十二烷基硫酸鈉（ SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?一種加陰離子去污劑 —SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ?樣品先被壓縮一個薄層，然后進(jìn)行電泳。 ?凝膠柱由二節(jié)凝膠組成（小節(jié)濃縮膠，大節(jié)分離膠）。 ? 不連續(xù)凝膠電泳： ?不連續(xù)凝膠由兩層組成，上層為濃縮層（丙烯酰胺 2~3%），下層為分離層（丙烯酰胺 5~25%）。 ?近來聚丙烯酰胺凝膠電泳法有了兩個新進(jìn)展： ? A、不連續(xù)凝膠電泳。因此，與凝膠的分子篩效應(yīng)（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。 緩沖系統(tǒng)的選擇原則 ?是兩種標(biāo)準(zhǔn)的對立權(quán)衡 –如果緩沖液的 pH選擇在遠(yuǎn)離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細(xì)而窄； –如果緩沖 pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇 pH ~，常用的緩沖液有 Tris甘氨酸（ pH ~）， Tris硼酸 (pH ~)和 Tris醋酸（ pH ~） 離子強度的選擇 ? 離子強度不宜過高，此時電導(dǎo)率低，產(chǎn)熱少，電泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)絮凝。 ? PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳 電泳前的準(zhǔn)備工作 ?緩沖系統(tǒng)的選擇： –保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持； –電泳時間和分辨率：從理論上講 PAGE可以在任何 pH進(jìn)行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理： ? 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級， 能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應(yīng) 。 ?聚丙烯酰胺含量 適用的分子量范
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