分離工程第八章ppt課件(編輯修改稿)
2025-10-08 18:21 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 15 10~50 15 10~200 20 2~15 20 5~150 凝膠濃度與分子量測定的關(guān)系 PAGE的具體操作過程 ? 制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠； ? 樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（ 1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍(lán)）； ? 電泳： 4~6小時，待 溴酚藍(lán) 前沿到達(dá)陽極底部； ? 檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍(lán) R250、銀染色 —靈敏度比考染高 100倍、熒光探針）； ? 照相、凝膠干燥： ? 定量測定： ?凝膠電泳：裝柱操作，鋪板操作。 ?近來聚丙烯酰胺凝膠電泳法有了兩個新進(jìn)展： ? A、不連續(xù)凝膠電泳。 ? B、十二烷基硫酸鈉 (SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ? 不連續(xù)凝膠電泳： ?不連續(xù)凝膠由兩層組成，上層為濃縮層（丙烯酰胺 2~3%），下層為分離層（丙烯酰胺 5~25%）。 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺為支持物，制成凝膠柱。 ?凝膠柱由二節(jié)凝膠組成（小節(jié)濃縮膠，大節(jié)分離膠）。這二節(jié)膠孔徑大小，緩沖液離子成分和離子強(qiáng)度值，電場強(qiáng)度都是不同的。 ?樣品先被壓縮一個薄層，然后進(jìn)行電泳。 ?一般經(jīng)過三個效應(yīng)，濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，電荷效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。 ? 十二烷基硫酸鈉（ SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?一種加陰離子去污劑 —SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ?主要用途： ?分離蛋白質(zhì)和測定它的相對分子量。 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 主要用于測定蛋白質(zhì) 亞基分子量 以及未知蛋白質(zhì)分子量的測定； ? 特點：設(shè)備簡單、操作簡便、測定快速、重復(fù)性高、樣品無需純化。 ?基本原理： ? SDS能以一定比例與蛋白質(zhì)結(jié)合，并使蛋白質(zhì)帶有大量的負(fù)電荷，（大大超過原來所帶電荷），從而使天然蛋白質(zhì)分子之間電荷差別下降乃至消除。同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也在 SDS作用下變的松散（蛋白質(zhì)變成多肽），形狀趨于一致，排除了電泳過程中電荷的影響，使SDS—聚丙烯酰胺電泳時，蛋白質(zhì)遷移率的差異僅是相對分子質(zhì)量的函數(shù)。 SDSPAGE 的原理 ? 蛋白質(zhì)分子的解聚 – SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵 ，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)；而 強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、 β巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。 –因此，在樣品和凝膠中加入 SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與 SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì) SDS膠束， 所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異 ；同時， 蛋白質(zhì) SDS聚合體的形狀也基本相同 ，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。 蛋白質(zhì)樣品用 SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變 未知蛋白質(zhì)分子量的測定 ?基于上述 SDSPAGE的原理介紹，我們可以利用 SDSPAGE電泳進(jìn)行未知蛋白質(zhì)的分子量測定； –以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行 SDSPAGE電泳得到不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷
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