基因工程育種碩士課程-文庫吧資料
2024-09-05 09:30本頁面
【正文】 取 圖 8 草菇轉(zhuǎn)化子基因組 DNA凝膠電泳結(jié)果 ? 基因組 DNA的酶切 圖 9 草菇轉(zhuǎn)化子基因組 DNA的酶切結(jié)果 ? Southern雜交分析 圖 10 轉(zhuǎn)化子基因組 DNA的 Southern 雜交結(jié)果 M為 DNA Marker λHindⅢ ； ck為 轉(zhuǎn)化的草菇 ； ck+為 質(zhì)粒 pgVvsmfc； （ a） 17分別為 TVM23 TVM23 TVM23 TVM231 TVM231 TVM231 TVM2314； （ b） 17分別為 TVM23 TVM23 TVM23 TVM23TVM23 TVM23 TVM239。 ? 插入法： 在目的基因中插入單個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，使原基因發(fā)生改變進(jìn)而改變基因產(chǎn)物。 五 . 基因定位誘變 ? 定位誘變方法 ? 刪除法 ： 在目的基因中刪除一個(gè)或若干個(gè)堿基序列，使基因發(fā)生重排而造成其性狀的改變。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然有效的遺傳工程系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于雙子葉植物和單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究上。該法亦可作為 REMI標(biāo)簽對功能基因進(jìn)行分離。此法應(yīng)用于旋孢菌（ Cochliobolus heterosporus ） 、 白色念球菌（ Candida albicans ） 和食用菌上的鬼傘（ Coprinus cinereus ）、 香菇（ ） 等的遺傳轉(zhuǎn)化均能有效地提高轉(zhuǎn)化率。 （四） 限制 性 酶介導(dǎo)的 DNA整合法 這是九十年代發(fā)展起來的一種能較大幅度提高轉(zhuǎn)化率的方法，其英文為 Restriction EnzymeMediated DNA Integration， 簡稱 REMI 。 微粒上的外源 DNA也隨之被帶入細(xì)胞并整合到植物染色體上 ， 得到表達(dá) ， 從而實(shí)現(xiàn)了基因的轉(zhuǎn)化 。 （ 三 ） 基因槍法 基 因 槍 法 又 稱 微 彈 轟 擊 法 （ Microprojectile bombardment） ,自 Klein TM等 1987年首次利用鎢粒對洋蔥的組織進(jìn)行轟擊試驗(yàn)以來 ， 已被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化 。該法自 1979年Zimmerann發(fā)明以來，經(jīng)過多年的研究和改進(jìn)，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究上。 主要原理： PEG能使細(xì)胞膜之間或 DNA與膜之間形成分子橋，促使細(xì)胞間的接觸和粘連，或是通過引起表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，而有利于細(xì)胞間的融合或外源 DNA的進(jìn)入。該基因是抗氟基吲哚（ 5fluoroindole,5FL） 代謝的，草菇和平菇對潮霉素不敏感，而對 5FL十分敏感，當(dāng)把 trp3iar 轉(zhuǎn)入草菇和平菇時(shí)，這兩種食用菌就能對 5FL產(chǎn)生抗性，達(dá)到篩選的目的 。 B)殺菌劑 Carboxin抗性基因（ CbxR） 。 在培養(yǎng)基中添加抗生素進(jìn)行篩選。 D) 腐草霉素抗性基因（ Phl+） 。 主要有： A) 卡那霉素抗性基因（ kan+） 。 D）銀耳肌醇營養(yǎng)缺陷型菌株。 ? 篩選標(biāo)記 （ 1）營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 ： 營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)標(biāo)記基因有 : A) ural（ 二氫乳清酸）基因，楊樹菇轉(zhuǎn)化 。 基因操作常用的限制性內(nèi)切酶是 II類。 I類和 III類限制性內(nèi)切酶兼有修飾（甲基化）作用以及依賴于 ATP的切割活性。 （五）環(huán)境處理： 構(gòu)建超級菌株 降解質(zhì)粒： （ 1）石油降解質(zhì)粒； （ 2）農(nóng)藥降解質(zhì)粒； （ 3）工業(yè)污染降解質(zhì)粒，如降解氯聯(lián)苯、尼龍低聚體、洗滌劑等； （ 4）抗金屬離子質(zhì)粒，如汞、砷、鎳、鈷、鎘、銅等 二 .目的基因的分離 ? 根據(jù)特異蛋白質(zhì)分離目的基因 ? 根據(jù)特異 mRNA分離目的基因 ? 利用 DNA插入分離目的基因（插入誘變法） ? 利用基因定位分離目的基因（圖位克隆法） ? 利用表達(dá)序列標(biāo)簽分離目的基因 ? 利用同源序列分離目的基因（同源克隆法） ? 根據(jù)特異 mRNA分離目的基因 （ 1）差別雜交（ differential hybridization） , 又稱：差別篩選（ differential screening） （ 2）縮減雜交（ subtractive hybridization）， 又稱：縮減 cDNA克?。? subtractive cDNA cloning） （ 3） mRNA差別顯示（ mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction, DDRTPCR） （
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