【正文】 ，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 載玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％紅細(xì)胞液,充分混勻靜置20 min , 低倍顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。3．試劑％生理鹽水、2％雞紅細(xì)胞、PBS 緩沖液、Alsever 溶液、 氯化鈉、 氯化銨、 硝酸鈉、 草酸銨、 硫酸鈉、 葡萄糖、 甘油、 乙醇、。由于各種溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度不同，所以不同的溶質(zhì)誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的時(shí)間不同，相反可通過(guò)測(cè)量溶血時(shí)間來(lái)估計(jì)細(xì)胞膜對(duì)各種物質(zhì)通透性的大小。本實(shí)驗(yàn)將紅細(xì)胞分別放于各種等滲溶液中，由于紅細(xì)胞膜對(duì)不同溶質(zhì)的通透性不同，使得不同溶質(zhì)透入細(xì)胞的速度相差很大，有些溶質(zhì)甚至不能透入細(xì)胞。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)。凝集素（lectin）是一類(lèi)含糖并能與糖分子專(zhuān)一結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用。繪圖紙上所有注字（包括姓名、實(shí)驗(yàn)日期、題目等）均用鉛筆書(shū)寫(xiě)，不能用其他筆寫(xiě)。圖繪好后，要在圖的右側(cè)注明各部分結(jié)構(gòu)名稱(chēng)，引線要直而平行，長(zhǎng)短適度，各引線不能交叉，各線右端上下對(duì)齊，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右寫(xiě)。觀察清楚后，選擇典型的細(xì)胞或組織，左眼看顯微鏡，右眼配合右手，先用鉛筆在紙上輕輕描出輪廓，使形狀正確，然后再用清晰的線條繪出，線條粗細(xì)要均勻不要重復(fù)。繪圖時(shí)，特別注意觀察物的形狀、各部分的位置、比例和毗鄰關(guān)系。細(xì)胞濃度計(jì)算 將四大格的細(xì)胞總數(shù)除以4，得出平均每大格的細(xì)胞數(shù)，乘以10000 即為1000mm3（1ml）?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】雞血涂片的制備與觀察顯微鏡觀察可見(jiàn)雞紅細(xì)胞為橢球形，有核。二次重復(fù)計(jì)數(shù)不應(yīng)超過(guò)177。計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。注意血細(xì)胞懸液不可滴的過(guò)多，如溢出或蓋玻片內(nèi)有氣泡必須重做，否則將影響計(jì)數(shù)結(jié)果。每個(gè)計(jì)數(shù)室分為9 個(gè)大正方格，每個(gè)大格邊長(zhǎng)為1mm ， ， 及每大格的容積為1mm1mm=。晾干，顯微鏡下觀察。雞血涂片的制備與觀察取雞血懸液，靠近一端滴在載片上．將另一載片的一端呈45176。試劑％生理鹽水、Ringer 氏液?！緦?shí)驗(yàn)用品】材料雞一只。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，先將培養(yǎng)細(xì)胞或血細(xì)胞稀釋成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)室四大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。例如：哺乳類(lèi)紅細(xì)胞成熟時(shí)細(xì)胞核消失。不論細(xì)胞的形狀如何，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大部分：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核?！净驹怼考?xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)是很多細(xì)胞的共同特點(diǎn)，在分化程度較高的細(xì)胞更為明顯，這種合理性是生物漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程所形成的。此外，Schiff 試劑的配制方法也可影響DNA 的染色反應(yīng)。有一大類(lèi)試劑均稱(chēng)為堿性品紅，它們實(shí)際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。但是水解時(shí)間長(zhǎng)短也要視標(biāo)本的類(lèi)型（如厚薄等)、固定劑的性質(zhì)以及酸的濃度而定?；蛩獾剡^(guò)于劇烈，則脫氧核糖也易掉下來(lái)，反應(yīng)也會(huì)減弱。水解時(shí)間：Feulgen 反應(yīng)通常用稀酸進(jìn)行水解，但水解的時(shí)間一定要適當(dāng)。但在上述固定劑中，以O(shè)sO4 和Carnoy 效果較好，OsO4（1%%)是Feulgen反應(yīng)的理想固定劑，只是因OsO4 價(jià)錢(qián)較貴，故一般多采用Carnoy 固定液。實(shí)踐證明，一切好的組織學(xué)固定劑均適用于Feulgen 反應(yīng)。固定劑的選擇：以前很多人認(rèn)為，選用的固定劑不應(yīng)含有醛基或含有氧化劑。對(duì)照切片應(yīng)不經(jīng)水解直接放在schiff 劑內(nèi)，且應(yīng)為負(fù)反應(yīng)。2．總結(jié)Feulgen 反應(yīng)染色結(jié)果的影響因素?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】細(xì)胞核中的DNA 呈鮮亮的紫紅色反應(yīng)，它不但反應(yīng)出DNA 存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應(yīng)的深淺，來(lái)判斷DNA 的相對(duì)含量。 壓片法 取一根尖置于載玻片上，用刀片切下生長(zhǎng)區(qū)部位（染成紫紅色），用拇指輕壓使細(xì)胞分散均勻，鏡檢。如果溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成水解過(guò)度，醣與醛基之間的鍵被破壞，醛基流失到水解液中；反之，不能出現(xiàn)潛在的醛基，都不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。重要的是溫度，應(yīng)保持在60177。然后吸去熱1mol/L HCl，換入冷1mol/L HCl洗1次，再用蒸餾水將根尖洗3次。水解 實(shí)驗(yàn)時(shí)，從冰箱取出預(yù)先準(zhǔn)備好的大蒜根尖，分裝到若干個(gè)青霉素瓶中，用自來(lái)水洗3次，蒸餾水水洗3次，換1mol/L HCl洗一次，傾去，換入預(yù)熱60℃的1mol/L HCl 3ml，放入恒溫水浴鍋中在60177?！痉椒ú襟E】材料準(zhǔn)備 取大蒜若干頭，剝皮后置于盛有水的培養(yǎng)皿內(nèi)使其長(zhǎng)出新根。亞硫酸水（洗滌劑）：用200ml 普通自來(lái)水（不要用蒸餾水, 以免引起誤差）、10ml 10%的偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。濾液應(yīng)為無(wú)色也無(wú)沉淀；貯于4℃冰箱中備用。2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3【實(shí)驗(yàn)用品】器材顯微鏡、立式染色缸、水浴鍋材料 香柏油，擦鏡紙，蓋玻片，載玻片試劑schiff 氏試劑 堿性品紅置入三角燒瓶?jī)?nèi)100ml沸騰的蒸餾水中，時(shí)時(shí)搖動(dòng)玻璃瓶，煮沸5min 使之充分溶解，冷卻至50℃時(shí)過(guò)濾，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃時(shí)， 偏重亞硫酸鈉（Na2S2O3），在室溫冷暗處至少放置24h（有時(shí)需2~3 天），使其顏色退至淡黃色，密封瓶口，藏于暗處，最好保存于4℃冰箱中（可保存數(shù)月或更長(zhǎng)時(shí)間）。也就是說(shuō), DNA 經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無(wú)色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA 的分布。其具體反應(yīng)原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA 分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。因?qū)NA 的顯示反應(yīng)具有高度專(zhuān)一性，故常被用來(lái)顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的分布情況。1按照內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)的要求，加入相應(yīng)的內(nèi)切酶、質(zhì)粒和內(nèi)切酶緩沖液；1混勻后，37℃水浴4小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。 +8|Pamp。 u|。cZQ,o 上清夜中加入等體積酚/氯仿（1：1）混勻，12500rpm,離心5min。amp。內(nèi)切酶。 1% 瓊脂糖凝膠：稱(chēng)取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻。溴化乙錠（EB）：10mg/mlRNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNasefree) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于20℃。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。TE：10mM TrisHCl(pH )，1mM EDTA(pH )。5M KAc 300ml，冰醋酸 ，加ddH2O至500ml。使用前臨時(shí)配置。溶液Ⅱ： NaOH，1% SDS。1M TrisHCl(pH ）， EDTA（pH ）10ml，加ddH2O至500ml。 Eppendorf，PCR管，tip頭 、燒杯、酒精燈、無(wú)菌牙簽、吸水紙，一次性塑料手套等。 U} EaV 【實(shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料上次實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化的菌落。再由異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒DNA。由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時(shí)前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開(kāi)；但后者完全變性分甚至出現(xiàn)斷裂，因此，使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時(shí)，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速?gòu)?fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則難以復(fù)性。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。其優(yōu)點(diǎn)是收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】六、堿裂解法小量提取質(zhì)粒及質(zhì)粒酶切【目的要求】 掌握堿裂解法小量提取質(zhì)粒的原理和方法，學(xué)習(xí)質(zhì)粒酶切的原理。然后37 ℃培養(yǎng)45分鐘；10. 取適量體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素的LB固體平板上，用滅過(guò)菌的玻璃棒涂布均勻。【方法步驟】 LB培養(yǎng)液中37℃過(guò)夜培養(yǎng)；，37℃；3. 取50ml菌液置于離心管內(nèi)，4 ℃ 4500g離心5分鐘；4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，搖蕩重懸細(xì)胞，冰浴30分鐘；5. 4℃ 4500g離心5分鐘收集細(xì)胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液； ,暫且不用的貯存于70℃可保存半年。g／mL濃度50100181。 鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無(wú)菌牙簽、吸水紙，一次性塑料手套等。【實(shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料Top10受體菌，上次實(shí)驗(yàn)的連接產(chǎn)物。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)（RestrictionModificatio n）缺陷的變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外源DNA的切割，用符號(hào)RM表示?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化【目的要求】掌握大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化的原理，熟悉實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。取5μl進(jìn)行電泳檢測(cè)。將吸附柱開(kāi)蓋置于室溫12min，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。向吸附柱中加入500μl漂洗液，13,000rpm離心1min，倒掉廢液。13000rpm離心1min，棄去收集管中液體，將吸附柱重新放入收集管中。若回收片段小于500bp或大于4kb，則需加入異丙醇（每100mg凝膠加異丙醇100μl），混勻?！痉椒ú襟E】紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的凝膠，稱(chēng)重。儀器臺(tái)式高速離心機(jī)、低溫水浴鍋、水浴鍋。這種方法一般稱(chēng)為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50～100倍。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70℃或72℃下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應(yīng)體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時(shí)（也有人報(bào)道處理1～2小時(shí)能提高克隆效率，這樣加T反應(yīng)會(huì)更徹底）。其原理是融化含有目的片段的瓊脂糖后，讓DNA吸附在硅基質(zhì)材料上，同時(shí)去除蛋白質(zhì)、其他有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)鹽離子及寡核苷酸等雜質(zhì)。DNA回收和純化常用方法有壓碎法、低融點(diǎn)瓊脂糖法、凍融法等，也有現(xiàn)成的試劑盒供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系___________________________________________________10X PCR buffer 10mMdNTP 正向引物 反向引物 模板 Taq DNA聚合酶 ddH2O ____________________________________________________總體積 5