【正文】 驊擷。()將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時，可使環(huán)在液體表面與管壁接觸的部分輕輕摩擦，接種后，塞上棉塞。．液體接種 這是由斜面培養(yǎng)基(或平板培養(yǎng)基)接種到液體培養(yǎng)基中的方法。視絀鏝鴯鱭鐘腦鈞欖糲僉爾魷癆駱鈐。()將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分(如斜面的頂端)，使其冷卻，以免燙死被接種的菌種。()在火焰旁，用右手拔掉棉塞。()將棉塞用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動，以利接種時拔出。斜面向上，管口齊平，并使它們位于水平位置。()將試管貼上標(biāo)簽、注明菌名、接種日期等。斜面培養(yǎng)基可用小試管(15mm150mm)制備，每管約裝一(／一／試管高度)，見圖－。攙閿頻嶸陣澇諗譴隴瀘鐙澮蹤島騁檻。鐒鸝餉飾鐔閌貲諢癱騮吶轉(zhuǎn)鮭錢驗(yàn)鎖。恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，則平板上即長出菌落。劃線后，將皿蓋蓋好。同時左手持培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀起一些，右手把接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿，將一環(huán)活性污泥在平板表面輕輕地劃線(千萬不要戳破培養(yǎng)基平板)，可作平行劃線、扇形劃線，或其它連續(xù)劃線。滅噯駭諗鋅獵輛覯餿藹猙廚憮犧駿灃。()制備平板培養(yǎng)基 將融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以無菌操作倒入無菌的空培養(yǎng)皿內(nèi)(操作方法同前，但培養(yǎng)皿內(nèi)末注入菌液)。．平板劃線分離。培養(yǎng)皿所以要倒置是為了防止培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)到皿蓋上而使培養(yǎng)基變干。將培養(yǎng)皿倒置于176。在傾注前，應(yīng)先將盛有培養(yǎng)基的管子的管口或瓶子的瓶口在火焰上微燒一周。)在稀釋菌液的同時，就要將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待融化的培養(yǎng)基冷到一176。每次吸取時，吸管都應(yīng)在菌液中反復(fù)吸洗幾次。()平板的制作)將無菌培養(yǎng)皿編號為、……(－、－、…－)。再從此濃度的菌液中吸取于第二管中，將吸管吸洗次，搖勻，即為稀釋倍的菌液，以同樣方法，依次類推，分別得到稀釋倍、倍及倍的菌液，所得菌液分別為、及(即－、－、－、－及－)等濃度?，撝C齷蘄賞組靄縐嚴(yán)減籩諏戀鄰驂灝。以上器材，除水樣或活性污泥、接種環(huán)、恒溫箱外，均在實(shí)驗(yàn)五中準(zhǔn)備好。．營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(已滅菌的) 、水樣或活性污泥。三、實(shí)驗(yàn)器材．無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)、無菌吸管、無菌錐形瓶、無菌試管、管無菌水(每管有滅菌過的自來水)。．確定其菌落觀察特征；獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等計數(shù)來完成的。．選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮揚(yáng)銥鯊臘騖韋。平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個方面：鋇嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團(tuán)藺締崳惲囂驁瘋。 掌握幾種常用的分離純化物的基本操作技術(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中仍要學(xué)習(xí)這兩種方法。溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應(yīng)釵藹紼較騮額。因此，為了從事以上這些研究工作，就必須學(xué)習(xí)微生物純種分離、培養(yǎng)及接種的技術(shù)，進(jìn)而再學(xué)會做微生物生理生化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，為廢水處理服務(wù)。我們除可用顯微鏡直接觀察微生物形態(tài)，大致了解其中的微生物種群外，更重要的還必須研究是哪些種類的微生物對該種廢水起生物氧化作用，其作用原理是什么，產(chǎn)生什么產(chǎn)物等等，以便提高處理效果。．微生物經(jīng)固定后，是死了呢還是仍活著?實(shí)驗(yàn)七 微生物純種分離、培養(yǎng)及接種技術(shù)本實(shí)驗(yàn)的對象是水樣或活性污泥中微生物的純種分離和培養(yǎng)。四、思考題．微生物的染色原理是什么?．你用革蘭氏染色法染色后看到的細(xì)菌是什么顏色，屬于革蘭氏陰性還是陽性?革蘭氏染色法在微生物學(xué)中有何重要意義?稟虛嬪賑維嚌妝擴(kuò)踴糶欏灣鯧飫驃餒。．加沙黃復(fù)染液，水洗。如脫色過度，則陽性菌會被誤染為陰性菌，而脫色不夠時，陰性菌將被誤染為陽性菌。為了節(jié)約酒精，也可將酒精滴至涂片上，靜置—后水洗。．加碘液后，水洗。三、操作方法及步驟革蘭氏染色．將實(shí)驗(yàn)所供菌種按單染色法作涂片、干燥并固定。)碘液碘 碘化鉀 蒸餾水 先將碘化鉀溶解在一小部分水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，然后加入其余的水即成。．顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈等。四、思考題．培養(yǎng)基是根據(jù)什么原理配制的?營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的成分各起什么作用?．為什么濕熱滅菌比干熱滅菌優(yōu)越?實(shí)驗(yàn)六 微生物的染色一、目的學(xué)習(xí)微生物涂片染色的操作技術(shù)、掌握微生物的革蘭氏染色法。所以所用培養(yǎng)皿、吸管、試管、錐形瓶、燒杯等玻璃器皿以及無菌水、培養(yǎng)基等的量均須根據(jù)下次實(shí)驗(yàn)所需準(zhǔn)備。．待已滅菌的物品冷卻后，置陰涼處。則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧華縉輅贊驏紆。．待壓力指針降到“”時，打開出氣口。詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁靈韜鰍櫝驥鱭。滅菌時間的長短由滅菌物品決定。．關(guān)閉出氣口后，器內(nèi)蒸汽將不斷增多，壓力和溫度隨著升高。這一點(diǎn)應(yīng)持別注意，因?yàn)槿绻淇諝鉀]有排盡，器內(nèi)雖然達(dá)到了一定的壓力，但并不會達(dá)到相應(yīng)所需的溫度。如滅菌器裝有溫度計，當(dāng)指針指到讀數(shù)℃時，證明器內(nèi)已經(jīng)充滿蒸汽、可以關(guān)閉出氣口。如熱源為蒸汽，則應(yīng)慢慢打開蒸汽進(jìn)口，不要讓蒸汽過猛地沖入滅菌器內(nèi)。．打開出氣口。轡燁棟剛殮攬瑤麗鬮應(yīng)頁諳絞綽髏鱉。有加水口的，水由加水口加入，由玻璃管看水位至止水線即停止加水。(四)高壓蒸汽滅菌上面所準(zhǔn)備好的一切玻璃器皿、培養(yǎng)基等均需進(jìn)行滅菌。無菌水常用來稀釋水樣。此種適量的水體積可在滅菌器內(nèi)由實(shí)驗(yàn)求得。)置高壓蒸汽滅菌器中，以℃(1kg／)滅菌，然后貯存于冷暗處備用。管口或瓶口均以棉花塞住。)乘熱用紗布或脫脂棉過濾(最好用保溫漏斗)，并分裝于試管中，每管約裝—。)用蒸餾水補(bǔ)充因蒸發(fā)而損失的水量?，嶀暈R曖惲錕縞馭篩涼貿(mào)錒戧晉魘繅。驍顧燁鶚巰瀆蕪領(lǐng)鱺賻驃弒綈閶魎齠。()斜面培養(yǎng)基的制作 將裝含有瓊脂的培養(yǎng)基的試管經(jīng)滅菌后，趁熱擱置在木條或木棒上，使試管呈適當(dāng)?shù)男倍?切勿傾斜過小，以免培養(yǎng)基沾污棉塞)。一般制備斜面培養(yǎng)基時，每支試管裝入的量約為試管高度的／—／。倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驁絛鯛鱧俁魷親。()分裝 將培養(yǎng)基分裝在試管和錐形瓶內(nèi)。()過濾 用沙布、濾紙或棉花過濾均可。裊樣祕廬廂顫諺鍘羋藺遞燦擾諗魴莖。難溶的原料如蛋白陳、肉膏、瓊脂等需加熱溶解，這時，當(dāng)原料全部溶解后應(yīng)加水補(bǔ)充因蒸發(fā)損失的水量。(二)培養(yǎng)基的制備．步驟()配制溶液 按培養(yǎng)基的配方，稱取各種原料。待滅菌的試管和瓶子的口都要用牛皮紙包裹，并用線繩捆扎后存放在鐵絲簍內(nèi)（用紙包裹是為了避免滅菌時冷凝水淋濕棉塞)，以備滅菌。在制作培養(yǎng)基的過程中，如不慎將棉塞沾上培養(yǎng)基時，應(yīng)用清潔棉花重做。棉塞的／應(yīng)在管內(nèi)或瓶口內(nèi)，上端露出少許，以便拔塞。做好的棉塞，四周應(yīng)緊貼管壁和瓶口，不留縫隙，以防空氣中微生物會沿棉塞皺折浸入。培養(yǎng)皿和吸管也有放在特制容器內(nèi)進(jìn)行滅菌的。交角，折疊包裝紙包住尖端(圖—)，用左手將吸管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，紙條即螺旋式地包在管子外面，余下紙頭折疊打結(jié)，按照實(shí)驗(yàn)需要，可單支包裝或多支包裝，以備滅菌。棉花要塞得松緊適宜，吸時既能通氣，又不致使棉花滑入管內(nèi)。．包裝()培養(yǎng)皿由一底一蓋組成一套，按實(shí)驗(yàn)所需的套數(shù)一起用牛皮紙包裝。洗刷干凈的玻璃器皿應(yīng)放在烘箱中烘干。培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自來水沖洗。．高壓蒸氣滅菌器、烘箱、冰箱、電爐等。．試紙—(或電位計或氫離子濃度比色計)、洗液、％、％。二、實(shí)驗(yàn)器材．培養(yǎng)皿(又稱平皿，直徑90mm)、試管、吸管、錐形瓶、燒杯等。．掌握培養(yǎng)基配制和無菌水制備的方法。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻減棲綜訴鮐巹。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括玻璃器皿的洗刷、包裝和培養(yǎng)基的制備以及滅菌技術(shù)等。穎芻莖蛺餑億頓裊賠瀧漲負(fù)這惻鮭觶。 ．嚴(yán)格按照顯微鏡的使用方法，依次逐個觀察細(xì)菌的形態(tài)、構(gòu)造及酵母菌、霉菌、放線菌的形態(tài)。()酵母菌、霉菌、放線菌。．示范片()金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、四聯(lián)球菌、尿八聯(lián)球菌、鏈球菌、球衣細(xì)菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等。．觀察霉菌、酵母菌、放線菌的形態(tài)和構(gòu)造，以便找出它們之間及與細(xì)菌之間的區(qū)別點(diǎn)。．觀察幾個典型細(xì)菌的形態(tài)(示范片)。四、思考題．常用的測定做生物生長的方法有哪幾種?試略加討論。．以細(xì)菌懸液光密度為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪出大腸桿菌正常、加酸和追加營養(yǎng)的條生長曲線，并加以比較，標(biāo)出正常生長曲線中對數(shù)期的大致位置，說明曲線變化原因。三、記錄及報告要求．記錄培養(yǎng)、之后細(xì)菌懸液的光密度值，以及加酸和追加營養(yǎng)液后，這三管菌液在所要求的培養(yǎng)時間時的光密度值。熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機(jī)庫圓鍰緘鶚鱭圓。從最稀濃度的細(xì)菌懸液開始，依次測定。以未接種的肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為空白對照，在波長下測菌懸液的光密度值()。用光密度值的大小來代表細(xì)菌的生長量。諺辭調(diào)擔(dān)鈧諂動禪瀉類謹(jǐn)覡鸞幀鮮奧。慫闡譜鯪逕導(dǎo)嘯畫長涼馴鴇撟鉍鲞謠。 酸處理的支試管，在培養(yǎng)后取出，加無菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝：：的體積比），然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)后取出，放入冰箱貯存。其中支，分別在培養(yǎng)、后取出，放冰箱中儲存，最后一起比濁測定。()培養(yǎng) 將接種后的支液體培養(yǎng)基，置于振蕩器或搖床上。接種后，輕輕搖蕩，使菌體均勻分布。 ．實(shí)驗(yàn)步驟()接種 取支裝有滅菌過的肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基試管(每管裝培養(yǎng)基)，貼上標(biāo)簽(注明菌名、培養(yǎng)時間等)。閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖輛塤鵜蘞鰱幟?？偩鷶?shù)(包括活菌和死菌的個數(shù))可在顯微鏡下直接計數(shù)而求得，由于細(xì)菌懸液的濃度與其渾濁度成正比，因此也可利用光電比色計測定細(xì)菌懸液的光密度，從而推知菌液的濃度，本實(shí)驗(yàn)就是利用光電比色計進(jìn)行量測（用平板計數(shù)法或稀釋計數(shù)法可測出活菌數(shù)，從而得出不包括死菌的生長曲線。測量微生物生長的方法有多種。最后，用比濁法測定菌體生長情況。．光電比色計、高壓蒸汽滅菌器、電冰箱、振蕩器或搖床等。鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫搖飭緡釷鯉憮。()大腸桿菌培養(yǎng)液 將大腸桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在℃下培養(yǎng)小時后，用無菌水加在斜面上，將菌洗下，作成一定濃度的細(xì)菌懸液，直接供實(shí)驗(yàn)接種用。()肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 配制方法同實(shí)驗(yàn)五中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，但不加瓊脂。()為了避免微生物游動而影響計數(shù)，可用接種環(huán)加一環(huán)氯化汞（）飽和溶液以殺死微生物。)上述計數(shù)方法僅適用于原生動物和輪蟲，對個體較大的微型動物和線蟲等，則須加大計數(shù)容量，以免造成誤差。)生物濾池和生物轉(zhuǎn)盤上的生物膜形成膠狀，濃度大，一般都必須稀釋后計數(shù)，其適當(dāng)?shù)南♂尡瓤稍趯?shí)踐中摸索。然后換算成混合液中的動物數(shù)。當(dāng)前一個視野數(shù)完，并做好記錄后，再換第二個視野，如此住復(fù)將整個蓋玻片下面的動物全部計數(shù)完畢。)將際本放在顯微鏡低倍鏡下計數(shù)。四、記錄微型動物優(yōu)勢種（數(shù)量及狀態(tài)）描述：其他種（種類、數(shù)量及狀態(tài)）描述：注：()如無計數(shù)板，則可用下法進(jìn)行計數(shù)：)取洗凈的滴管支（其每一滴水的體積應(yīng)預(yù)先標(biāo)定）吸取混合均勻的曝氣池混合液或已稀釋的混合液，滴滴在載玻片的中央，以蓋玻片（以方形為好）輕輕蓋上水滴，要避免蓋玻片內(nèi)形成氣泡。．計算 設(shè)在一滴水中測得鐘蟲只，則每混合液中含有鐘蟲＝只，如測得輪蟲只，則每毫升混合液含輪蟲＝只(如滴管每一摘體積為／，所觀察的液體是：稀釋的曝氣池混合液)。構(gòu)氽頑黌碩飩薺齦話騖門戲鷯瀏鯪晝。．用低倍顯微鏡進(jìn)行計數(shù) 注意所滴加的液體不一定布滿整個格小方格，在顯微鏡下計數(shù)時只要把充有液體的小方格，挨著次序一行行的計算即可。 ．取洗凈的滴管一支(滴管每滴水的體積應(yīng)預(yù)先標(biāo)定，一般每一滴水的體積約為／)，吸取搖勻的混合液或己稀釋的混合液加一滴到計數(shù)板的中央方格內(nèi)，然后加上一塊潔凈的大號蓋玻片，使玻片的四周正好擱在計數(shù)板四周凸起的邊框上，側(cè)視如圖—所示。三、計數(shù)方法及步驟 ．將活性污泥法曝氣池混合液輕輕攪拌均勻；如混合液較濃，則可稀釋成：的液體(稀釋方法：取量筒一個，加混合液再加蒸餾水，輕輕攪拌均勻，即成：稀釋液)。關(guān)于氫氟酸腐蝕法劃方格的方法是先將玻璃表面涂一層薄面均勻的石蠟，然后用尖針在石蠟層上刻出所要求的方格，再以氫氟酸蒸汽進(jìn)行重蒸。這樣，就制成了一塊微型動物計數(shù)板，如圖—所示。利用氫氟酸腐蝕法，使玻板中央刻上＝個小方格，小方格的大小沒有嚴(yán)格規(guī)定，只要一片大號蓋玻片能蓋滿格子有余和便于在顯微鏡下計數(shù)就可以了。．計數(shù)板 如果沒有微型動物計數(shù)的計數(shù)板(微型動物，即使是原生動物，也比細(xì)菌大得多，—般的細(xì)菌或血球計數(shù)板都不適用)，則可按照上海織襪四廠和上海師范大學(xué)生物系所介紹的微型動物計數(shù)板制作方法制備如