【正文】 1000ml：（）%Giemsa染液（以上述緩沖液配制）三、器材： 恒溫箱（37oC） 水浴鍋（4550oC） 紫外線燈（20或30W） 鋁飯盒 擦鏡紙 鐵絲架 吸管、鑷子 染片玻璃架四、操作方法： ，在加入Brdu后，其最終濃度為10181。二、Brdu溶液的配制：： Brdu 5mg 無(wú)菌生理鹽水 10ml 溶液裝入無(wú)菌青霉素瓶，黑色紙避光，置于4oC冰箱保存。因此，先用紫外線照射，使Brdu光解，然后以Giemsa染色時(shí)，則有色差出現(xiàn)，BB型染色單體染色淺，BT型染色單體色深。其中一條DNA分子仍屬于BT型，另外一條則是兩條單鏈都含有Brdu，到中期時(shí)為BB染色單體，如圖所示： Hoechst 33258 在對(duì)這種染色單體染色時(shí)，就發(fā)生著色程度的差別。 1973年Latt發(fā)現(xiàn)讓細(xì)胞在含Brdu的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了2個(gè)細(xì)胞周期，再以Hoechst33258染色后，兩條姐妹染色單體就出現(xiàn)了色差，這就是姐妹染色但提到區(qū)分染色（Sister Chromatid Diffeientiation SCD）。２. 描述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所出現(xiàn)的現(xiàn)象，試解釋之。 。 ，如分裂相多，分散較好時(shí)，繼續(xù)做下列步驟，如不多且分散不好，則停止，如僅是分散不好，可以再固定一次。 ，視細(xì)胞數(shù)量多少加入051ml新鮮固定液，將沉淀打成懸液。 ，以1000rpg離心5分鐘，去上清夜。 ：加1ml新鮮配制的固定液，打勻細(xì)胞，立即以1000rpg離心10分鐘，移去上清夜。 ，蓋上離心機(jī)套，打開(kāi)電源，待速度升到1500rpm時(shí)，離心8分鐘。 ，用吸管將沉于瓶底的細(xì)胞沖散均勻，將細(xì)胞懸液移進(jìn)離心管中。４. 染 液：2%Giemsa （二）器材： ５100 ml血漿瓶 ml量筒７1 ml，2 ml注射器 （使用前存冰箱中）　?。?7oC） （10 ml） ，定時(shí)鐘 ，橡皮頭 （三）實(shí)驗(yàn)材料： 人血 或 豬血四、實(shí)驗(yàn)步驟：：在超凈工作臺(tái)上，用吸管吸取RPMI1640液10 ml，用1 ml， ml， ml（各10000單位/ ml），%的NaHCO3，然后用5 ml吸管分裝，每小瓶5 ml，用膠布封口。２. 低滲液：％KCl，預(yù)溫在37oC。用低滲鹽溶液（%）處理，使其中的紅細(xì)胞及分裂相細(xì)胞的膜破裂并使轉(zhuǎn)化細(xì)胞膨脹，結(jié)合離心技術(shù)，可將紅細(xì)胞碎片及分裂相細(xì)胞膜和一部分細(xì)胞質(zhì)除去，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體標(biāo)本。二、實(shí)驗(yàn)原理： 染色體是細(xì)胞遺傳的研究對(duì)象，分析認(rèn)識(shí)眼行為對(duì)于認(rèn)識(shí)遺傳物質(zhì)的傳遞、復(fù)制、畸變等都有重要的意義。７. 用蒸餾水洗12次，細(xì)胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，就可以看到由微絲、微管組成的網(wǎng)絡(luò)。５. ，每次十分鐘。３. 吸去Triton X100，用M緩沖液洗三次，每次三分鐘。12H2O 加水到 1000 ml　　　　 １％Triton X100：以M緩沖液配制　　　 ３％戊二醛： 25％戊二醛 12 ml 6nm磷酸緩沖液 88 ml 染料： 考馬斯亮藍(lán) R250 冰醋酸 7 ml 甲醇 ml 蒸餾水 ml三、實(shí)驗(yàn)操作：１. 撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮表皮細(xì)胞（約1cm2）若干片置于盛有6mH ，使其下沉。由于細(xì)胞經(jīng)Triton X100提取剩下的主要成分是細(xì)胞骨架成分，使得顯現(xiàn)等價(jià)清晰。 微絲、微管、中間纖維等都是直徑很小的結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞骨架在通常固定條件下不穩(wěn)定，如低溫、高壓、酸處理等。2. 列表顯示你所觀察到的幾種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的亞顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（三種以上） 實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞骨架的顯示及光鏡觀察一、原理： 細(xì)胞內(nèi)由微絲、微管、中間纖維等交織形成一個(gè)十分復(fù)雜的立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。3. 聽(tīng)老師介紹掃描電鏡下的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 聽(tīng)老師介紹如何制取玻璃刀，做超薄切片，觀看老師演示。物鏡下面的樣品室內(nèi)裝有可以移動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)和傾斜的樣品臺(tái)。放大倍數(shù)是顯像管上掃描幅度與樣品上掃描幅度之比，可從幾十倍連續(xù)地變化到幾十萬(wàn)倍。放在樣品旁的閃爍晶體接收這些次級(jí)電子，通過(guò)放大后調(diào)制顯像管的電子束強(qiáng)度，從而改變顯像管熒光屏上的亮度。 中間鏡主要通過(guò)對(duì)勵(lì)磁電流的調(diào)節(jié)，放大倍數(shù)可從幾十倍連續(xù)地變化到幾十萬(wàn)倍；改變中間鏡的焦距，即可在同一樣品的微小部位上得到電子顯微像和電子衍射圖像。電子束通過(guò)樣品后由物鏡成像于中間鏡上，再通過(guò)中間鏡和投影鏡逐級(jí)放大，成像于熒光屏或照相干版上。反之，樣品中較厚或較密的部分，在圖像中則顯得較暗。在這種電子顯微鏡中，圖像細(xì)節(jié)的對(duì)比度是由樣品的原子對(duì)電子束的散射形成的。 投射式電子顯微鏡因電子束穿透樣品后，再用電子透鏡成像放大而得名。透射式電子顯微鏡常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細(xì)微物質(zhì)結(jié)構(gòu)；掃描式電子顯微鏡主要用于觀察固體表面的形貌，也能與 X射線衍射儀或電子能譜儀相結(jié)合，構(gòu)成電子微探針，用于物質(zhì)成分分析；發(fā)射式電子顯微鏡用于自發(fā)射電子表面的研究。 電子槍是由鎢絲熱陰極、柵極和陰極構(gòu)成的部件?，F(xiàn)代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由很穩(wěn)定的直流勵(lì)磁電流通過(guò)帶極靴的線圈產(chǎn)生的強(qiáng)磁場(chǎng)使電子聚焦。 電子顯微鏡由鏡筒、真空系統(tǒng)和電源柜三部分組成。由于電子束的波長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可見(jiàn)光的波長(zhǎng)，所以即使電子束的錐角僅為光學(xué)顯微鏡的1％，電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于光學(xué)顯微鏡?？梢?jiàn)光的波長(zhǎng)約為300～700納米，而電子束的波長(zhǎng)與加速電壓有關(guān)。 電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)雖已遠(yuǎn)勝于光學(xué)顯微鏡，但電子顯微鏡因需在真空條件下工作，所以很難觀察活的生物，而且電子束的照射也會(huì)使生物樣品受到輻照損傷。在中國(guó)，1958年研制成功透射式電子顯微鏡，其分辨本領(lǐng)為3納米。1932年，經(jīng)過(guò)魯斯卡的改進(jìn)，電子顯微鏡的分辨能力達(dá)到了50納米，約為當(dāng)時(shí)光學(xué)顯微鏡分辨本領(lǐng)的十倍，于是電子顯微鏡開(kāi)始受到人們的重視。20世紀(jì)70年代，()。附：磷酸緩沖液（PBS）的配方： 1/15M (或Na2HPO4. 12H2O) KH2PO4 加蒸餾水至 1000mL 實(shí)驗(yàn)四 電鏡參觀一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私怆娮语@微鏡的工作原理，判斷和識(shí)別電鏡下的各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)。3. 固定標(biāo)本染色：到一染色體制片在100%、80%、50%乙醇中依次2分鐘，%吖啶橙PBS中1分鐘，以PBS封片觀察，核及染色體為綠色熒光，質(zhì)為紅色熒光。 六、觀察：1. 葉綠素自發(fā)熒光，取一葉片，以刀片橫切一盡量薄的小片，滴一滴生理鹽水觀察葉綠素為紅色熒光。2. 調(diào)節(jié)燈源的激光透鏡調(diào)節(jié)環(huán)，使光線平行的投射到反光鏡上（用平面鏡反光），并調(diào)整反光鏡的方向使視野達(dá)到最佳亮度效果。 酒精100%、80%、50%、 （1/15M）、吖啶橙染液。 四、器材及試劑： 顯微鏡、熒光光源、激發(fā)濾片、吸收濾片、染缸、鑷子、載片、蓋片、刀片、吸管等。 許多物質(zhì)對(duì)熒光也有猝滅作用，如鹵酸鹽，以碘鹽為最強(qiáng)，具氧化作用的物質(zhì)如硝基苯等，鐵、銀離子等也具有猝滅作用。 %時(shí)染色活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色，超出該范圍便失去紅綠效應(yīng)。 熒光色素液的濃度對(duì)染色影響也很大，絕大多數(shù)熒光染料在固體狀態(tài)下不發(fā)生熒光或熒光很弱，只有在溶液中才能顯現(xiàn)熒光，當(dāng)濃度極稀時(shí)，濃度增加，熒光增加，但到達(dá)某一極限后，繼續(xù)提高濃度，熒光反而下降。 pH的改變將會(huì)明顯改變熒光色素的光譜，并且明顯影響熒光色素的吸光能力和熒光效率，每一種熒光色素均有其最適pH值。 熒光色素的熒光強(qiáng)弱與色素的分子結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系，直接受環(huán)境條件的影響，所以了解熒光色素的各種性質(zhì)，選用適當(dāng)材料，以獲得良好的觀察效果。 三、熒光色素： 熒光色素可用做染料，當(dāng)它與動(dòng)物或植物細(xì)胞內(nèi)某些成分結(jié)合后，發(fā)生一定波長(zhǎng)的熒光。 熒光顯微鏡中還安有吸收濾片，以獲得清楚的熒光映象及保護(hù)觀察者的眼睛。這些激發(fā)濾片有各種型號(hào)，每種型號(hào)允許一定波長(zhǎng)的光通過(guò)。 熒光顯微鏡的光源一般為超高壓汞燈，少數(shù)用疝燈或高色溫溴、鎢燈，前兩者可獲得叫強(qiáng)的紫外線，后者產(chǎn)生紫藍(lán)光。 落射式熒光顯微鏡讓激發(fā)光照射在待測(cè)材料上，也叫表面熒光顯微鏡，是近年來(lái)研究發(fā)展起來(lái)的一種新式顯微鏡，優(yōu)點(diǎn)是放大倍數(shù)越大熒光越強(qiáng)，益于高倍研究。 透射式熒光顯微鏡是比較舊式的顯微鏡。以確定細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體的存在及分布上，由于 該法是免疫學(xué)技術(shù)和熒光染色技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種方法，它具有免疫學(xué)的特異性和熒光方法的敏感性，作為一種研究方法或?qū)嶒?yàn)手段，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，列如顯示膜的流動(dòng)性的方法，顯示細(xì)胞骨架的方法等。 [2].免疫熒光技術(shù)：又叫熒光抗體方法，它是利用抗體的特異結(jié)合現(xiàn)象。 除少數(shù)物質(zhì)具有較強(qiáng)的自發(fā)熒光外，大多數(shù)細(xì)胞的自發(fā)熒光否很弱，不能滿足實(shí)際工作的要求，現(xiàn)在比較廣泛利用的是間接熒光，獲得間接熒光的方法有兩種： [1].熒光染色法：利用熒光染料使細(xì)胞或組織著色，它和細(xì)胞內(nèi)不同成分結(jié)合后可發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光。這種現(xiàn)象稱為自發(fā)式熒光，或直接熒光。 當(dāng)某一物質(zhì)的外層電子接收到能量相當(dāng)時(shí)的光量子后，這個(gè)電子就會(huì)從能級(jí)較低的電子層躍遷到能級(jí)較高的電子層（激發(fā)態(tài)），但激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的，大約經(jīng)過(guò)10ˉ8秒，電子就會(huì)以輻射光量子的形式釋放能量而回到原來(lái)的穩(wěn)定狀態(tài)，輻射的光量子就是光（如圖），因?yàn)槟芰窟€有一部分是以熱能的形式散發(fā)的，所以熒光光波比激發(fā)的光波長(zhǎng)。 繪制暗視野顯微鏡下的原生動(dòng)物圖。 在使用暗視野顯微鏡時(shí)，反復(fù)調(diào)焦都不能看見(jiàn)被檢物，有什么可能的原因。 虹彩光闌必須開(kāi)到最大。 暗視野照明時(shí)，否則會(huì)應(yīng)因鏡口率太大而達(dá)不到暗視野照明效果。 照明光線要強(qiáng)，因此應(yīng)用顯微鏡燈而不用自然光。 仔細(xì)調(diào)焦，觀察原生動(dòng)物如草履蟲、棘尾蟲等的形態(tài)特征。（三）、材料觀察： 用吸管吸一滴糖水滴于載玻片上，加蓋蓋玻片，如水太多，用濾紙吸干。按聚光器下透鏡的上表面直徑ф剪下一黑紙，并一將邊緣1/5剪去，剪成如圖所示的形狀。普通顯微鏡在明視野照明觀察物體時(shí)，但是在暗視野照明條件下。暗視野顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡相比，在于它所使用的聚光器是暗視野聚光器， 聚光器的中央照明光束完全被擋住，形成暗視野，如圖：由于暗視野顯微鏡的照明方法主要是利用被物體表面散射光來(lái)觀察物體，所以能看見(jiàn)物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。而是讓照明燈光傾斜的照在標(biāo)本上。（一） 原理及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：暗視野顯微鏡的設(shè)計(jì)原理是以Tyndal效應(yīng)為基礎(chǔ)的，光線通過(guò)膠體介質(zhì)時(shí)，介質(zhì)會(huì)對(duì)光發(fā)生強(qiáng)烈的散射，如房間中的細(xì)小塵埃本不能被看見(jiàn)，但當(dāng)一束強(qiáng)光照進(jìn)房間時(shí)，我們從照明光束的側(cè)面觀察時(shí)，就可以看見(jiàn)塵埃。 [2].觀察未染色的染色體制片標(biāo)本 染色體標(biāo)本是利用哺乳動(dòng)物的外周血培養(yǎng)，空氣干燥法制片獲得，觀察中染色體和淋巴母細(xì)胞核。 （五）利用相差顯微鏡觀察標(biāo)本： [1].紫鴨 草花絲絨毛細(xì)胞的原生質(zhì)環(huán)流 用鑷子小心從基部摘取一先活紫鴨草花絲，置于載片上，滴一滴生理鹽水，加蓋玻片，相差顯微鏡下觀察。 [5].拔出望遠(yuǎn)鏡，換入目鏡即可開(kāi)始做鏡檢觀察，環(huán)狀光闌也應(yīng)做相應(yīng)轉(zhuǎn)換。 [3].雙手輕按環(huán)狀光闌調(diào)中螺桿（有的是臨時(shí)時(shí)插入），并轉(zhuǎn)動(dòng)，使環(huán)狀光闌移到環(huán)狀光闌與相板共軛面完全重合為止，對(duì)于Olympus，調(diào)節(jié)好一種物鏡，其余則全業(yè)合軸。 調(diào)節(jié)方法如下： [1].從目鏡筒中拔出目鏡。 [9].使聚光器升至頂點(diǎn)，光路調(diào)中即告完成。 [7].雙手調(diào)節(jié)聚光