【正文】 ）混合液擦去鏡上殘余的鏡油，最后用干擦鏡紙擦干，擦永久玻片或物微尺，方法類似。小心移動物微尺和轉(zhuǎn)動目鏡，使兩尺平行，起點線重合，如下圖：然后找出另一處兩尺刻度重合處，記錄起點線到重合線之間各尺的刻度數(shù)（格數(shù)），按下式計算。五、 實驗操作 目微尺的標(biāo)定（1） 卸下目鏡的上透鏡（如為Olympus顯微鏡，則卸下目鏡下方的金屬環(huán)），將目微尺刻度向下裝在目鏡的焦平面上，再旋上上透鏡（金屬環(huán)）。光線通過載片后，可直接透過香柏油而進(jìn)入物鏡，折射程度輕，這樣物鏡的鏡口率增大，從而提高物鏡的分辨率。當(dāng)測量細(xì)胞的大小時，不能用物微尺直接測量細(xì)胞，而只能使用目微尺。離開前要關(guān)好門、窗、水、電。（七）本實驗室歡迎各位實驗者對每一實驗本身提出新的看法與做法，至于能否采用，視具體情況而定。（五）取用各種試劑，要用及時蓋上瓶蓋。使用有毒物品、強酸、強堿等，應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程。（三）實驗室內(nèi)的一切儀器、物品必須愛護(hù)。本桌的顯微鏡一律不準(zhǔn)搬離本實驗桌。用擦鏡紙蘸取少量鏡頭清洗液，先從鏡頭的中央開始清洗，輕輕旋轉(zhuǎn)擦至鏡頭的邊緣部分，如此重復(fù)2－3次。66實驗室規(guī)則與操作要求為獲得較好的實驗結(jié)果，避免發(fā)生差錯與意外事故，特制定以下規(guī)則與要求，希望實驗者能嚴(yán)格遵守。 50實驗二十 植物愈傷組織培養(yǎng)以及再分化41實驗十六 早熟染色體凝集（PCC） 32實驗十三 細(xì)胞融合 19實驗九 葉綠體的制備及其對染料的還原 17實驗八 堿性磷酸酶的顯示 2實驗二 相差和暗視野顯微鏡的原理、使用及標(biāo)本觀察實驗課的基本任務(wù)是，讓學(xué)生學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)基本技術(shù)，使他們具有一定的實驗操作技能，并培養(yǎng)他們樹立獨立設(shè)計實驗的思考觀念和進(jìn)行科研的基本素質(zhì)。生命科學(xué)中的各個學(xué)科領(lǐng)域，甚至非生命科學(xué)的許多學(xué)科領(lǐng)域中的學(xué)者們，越來越多地投入到對細(xì)胞生命現(xiàn)象的研究。細(xì)胞是生命的載體，不理解細(xì)胞就不理解生命。我們借鑒兄弟院校的經(jīng)驗編寫了這本《細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)》，供我院開設(shè)的各專業(yè)選用。 5實驗三 熒光顯微鏡原理及應(yīng)用 22實驗十 人體細(xì)胞核型圖的制作 43實驗十七 細(xì)胞同步化52實驗二十一 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟 57實驗二十二 細(xì)胞器的分離 62實驗二十三 石蠟切片的制作（一）顯微鏡的使用及保護(hù)① 顯微鏡是細(xì)胞生物學(xué)實驗的主要觀察工具，使用時必須注意保持外觀整潔、防濕、防高溫、防藥品侵蝕，使用時勿使染液或其它溶液沾污鏡頭，一旦沾污，及時用擦鏡紙蘸上鏡頭清洗液（無水乙醚：無水乙醇＝7：3）輕輕擦拭干凈。④ 載物臺必須保持清潔，必要時亦可用擦鏡紙蘸少量清洗液擦試載物臺。若需使用者，可到該桌使用，使用后務(wù)必保持該顯微鏡的清潔。節(jié)約材料、藥品，取用時不要過量。易燃物品遠(yuǎn)離火源。按獻(xiàn)寶取出所需之藥品或溶液后，不得將原液倒回瓶內(nèi)。任何人未經(jīng)老師許可，不得自作主張，改動任何實驗步驟與操作方法。 實驗一、細(xì)胞形態(tài)及大小的觀測一、 目的：1. 觀測細(xì)胞形態(tài)及大小，了解細(xì)胞的分類2. 學(xué)習(xí)顯微測量的方法3. 學(xué)習(xí)使用油鏡二、 測微技術(shù)的原理：顯微側(cè)微尺分為物鏡測微尺（簡稱物微尺或臺微尺）和目鏡測微尺（簡稱目微尺）。因目微尺測量的是細(xì)胞經(jīng)物鏡放大后的像，因而它每格所代表的實際長度隨物鏡的放大率而變，在測量時需先用物微尺標(biāo)定，求出某一放大率時目微尺每格所代表的實際長度，然后再用以測量細(xì)胞大小。顯微鏡的分辨力與物鏡的鏡口率成反比，與光線的波長成正比；即：R=從上式可知提高介質(zhì)的折射率可以提高顯微鏡的分辨能力，可見光平均波長為550nm即黃綠光。將目鏡插入鏡筒。在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表的實際長度：目微尺每格所代表的實際長度（μ）=臺微尺格數(shù)/目微尺格數(shù)*10（μ）（3） 換上待測標(biāo)本，既可進(jìn)行測量。觀察及測量（1） 多角形細(xì)胞：觀察小白鼠肝細(xì)胞，細(xì)胞呈多角形，分界不太明顯，以蘇木精伊紅染色，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核染成蘭色，測量其細(xì)胞及細(xì)胞核的長短徑。（5） 卵園形細(xì)胞：觀察人血細(xì)胞涂片中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞。2) 中期：（Metephase），染色體分布在赤道面上。b， 觀察河蚌外套膜表皮細(xì)胞；高爾基體染成棕色，呈網(wǎng)狀，分布在柱狀上皮的遠(yuǎn)心端（有極性分布）。即主要分布在細(xì)胞的頂部和基部。在實際工作中，許多的工作要求我們觀察活細(xì)胞，人們設(shè)計了適合上述目的的觀察工具，相差顯微鏡就是其中一種。在普通顯微鏡下，疊加結(jié)果沒有明顯變化，故我們觀察不到標(biāo)本及其細(xì)微結(jié)構(gòu)（圖1a）。如果推遲直射光的相位1/4λ，則直射光和衍射光的相位相同，發(fā)生相長干涉，合成干涉比直射光明亮，稱負(fù)反差（如圖1b）。環(huán)狀光闌是裝在聚光鏡中的環(huán)狀通光孔（圖2a），隨著物鏡倍數(shù)的改變，要改變其大小。如涂在補償面，則推遲衍射相位，形成暗反差（正反差），即標(biāo)本比周圍介質(zhì)暗，在相板上還覆蓋有吸收膜，吸收掉一部分的光線，多數(shù)是鑲在共軛面上，以吸收一部分直射光使其振幅與衍射光相近，這樣合成光與直射光反差 才明顯。 獲得綠光，還兼有吸熱作用，由于相差顯微鏡的環(huán)狀光闌通光孔較小，故需較強的照明光源，一般均用人工光源。 [3].轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤，使“0”進(jìn)入標(biāo)示孔。 [7].雙手調(diào)節(jié)聚光器的兩個調(diào)中螺桿，使視場中心移至視野中央。 調(diào)節(jié)方法如下： [1].從目鏡筒中拔出目鏡。 [5].拔出望遠(yuǎn)鏡，換入目鏡即可開始做鏡檢觀察，環(huán)狀光闌也應(yīng)做相應(yīng)轉(zhuǎn)換。 [2].觀察未染色的染色體制片標(biāo)本 染色體標(biāo)本是利用哺乳動物的外周血培養(yǎng)，空氣干燥法制片獲得，觀察中染色體和淋巴母細(xì)胞核。而是讓照明燈光傾斜的照在標(biāo)本上。普通顯微鏡在明視野照明觀察物體時，但是在暗視野照明條件下。（三）、材料觀察： 用吸管吸一滴糖水滴于載玻片上，加蓋蓋玻片，如水太多，用濾紙吸干。 照明光線要強，因此應(yīng)用顯微鏡燈而不用自然光。 虹彩光闌必須開到最大。 繪制暗視野顯微鏡下的原生動物圖。這種現(xiàn)象稱為自發(fā)式熒光，或直接熒光。 [2].免疫熒光技術(shù)：又叫熒光抗體方法，它是利用抗體的特異結(jié)合現(xiàn)象。 透射式熒光顯微鏡是比較舊式的顯微鏡。 熒光顯微鏡的光源一般為超高壓汞燈，少數(shù)用疝燈或高色溫溴、鎢燈，前兩者可獲得叫強的紫外線，后者產(chǎn)生紫藍(lán)光。 熒光顯微鏡中還安有吸收濾片，以獲得清楚的熒光映象及保護(hù)觀察者的眼睛。 熒光色素的熒光強弱與色素的分子結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系，直接受環(huán)境條件的影響，所以了解熒光色素的各種性質(zhì)，選用適當(dāng)材料，以獲得良好的觀察效果。 熒光色素液的濃度對染色影響也很大，絕大多數(shù)熒光染料在固體狀態(tài)下不發(fā)生熒光或熒光很弱，只有在溶液中才能顯現(xiàn)熒光，當(dāng)濃度極稀時，濃度增加，熒光增加，但到達(dá)某一極限后，繼續(xù)提高濃度，熒光反而下降。 許多物質(zhì)對熒光也有猝滅作用，如鹵酸鹽，以碘鹽為最強，具氧化作用的物質(zhì)如硝基苯等，鐵、銀離子等也具有猝滅作用。 酒精100%、80%、50%、 （1/15M）、吖啶橙染液。 六、觀察：1. 葉綠素自發(fā)熒光，取一葉片，以刀片橫切一盡量薄的小片，滴一滴生理鹽水觀察葉綠素為紅色熒光。附：磷酸緩沖液（PBS）的配方： 1/15M (或Na2HPO4. 12H2O) KH2PO4 加蒸餾水至 1000mL 實驗四 電鏡參觀一、實驗?zāi)康模毫私怆娮语@微鏡的工作原理，判斷和識別電鏡下的各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)。1932年，經(jīng)過魯斯卡的改進(jìn)，電子顯微鏡的分辨能力達(dá)到了50納米，約為當(dāng)時光學(xué)顯微鏡分辨本領(lǐng)的十倍，于是電子顯微鏡開始受到人們的重視。在中國，1958年研制成功透射式電子顯微鏡，其分辨本領(lǐng)為3納米。 電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)雖已遠(yuǎn)勝于光學(xué)顯微鏡，但電子顯微鏡因需在真空條件下工作，所以很難觀察活的生物，而且電子束的照射也會使生物樣品受到輻照損傷。由于電子束的波長遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可見光的波長，所以即使電子束的錐角僅為光學(xué)顯微鏡的1％，電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于光學(xué)顯微鏡。 電子顯微鏡由鏡筒、真空系統(tǒng)和電源柜三部分組成。透射式電子顯微鏡常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細(xì)微物質(zhì)結(jié)構(gòu)；掃描式電子顯微鏡主要用于觀察固體表面的形貌，也能與 X射線衍射儀或電子能譜儀相結(jié)合，構(gòu)成電子微探針，用于物質(zhì)成分分析；發(fā)射式電子顯微鏡用于自發(fā)射電子表面的研究。 投射式電子顯微鏡因電子束穿透樣品后，再用電子透鏡成像放大而得名。反之，樣品中較厚或較密的部分，在圖像中則顯得較暗。放在樣品旁的閃爍晶體接收這些次級電子，通過放大后調(diào)制顯像管的電子束強度，從而改變顯像管熒光屏上的亮度。物鏡下面的樣品室內(nèi)裝有可以移動、轉(zhuǎn)動和傾斜的樣品臺。3. 聽老師介紹掃描電鏡下的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞骨架在通常固定條件下不穩(wěn)定，如低溫、高壓、酸處理等。由于細(xì)胞經(jīng)Triton X100提取剩下的主要成分是細(xì)胞骨架成分，使得顯現(xiàn)等價清晰。３. 吸去Triton X100，用M緩沖液洗三次，每次三分鐘。７. 用蒸餾水洗12次，細(xì)胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，就可以看到由微絲、微管組成的網(wǎng)絡(luò)。二、實驗原理： 染色體是細(xì)胞遺傳的研究對象，分析認(rèn)識眼行為對于認(rèn)識遺傳物質(zhì)的傳遞、復(fù)制、畸變等都有重要的意義。２. 低滲液：％KCl，預(yù)溫在37oC。 ，用吸管將沉于瓶底的細(xì)胞沖散均勻，將細(xì)胞懸液移進(jìn)離心管中。 ：加1ml新鮮配制的固定液，打勻細(xì)胞，立即以1000rpg離心10分鐘，移去上清夜。 ，視細(xì)胞數(shù)量多少加入051ml新鮮固定液，將沉淀打成懸液。 。 1973年Latt發(fā)現(xiàn)讓細(xì)胞在含Brdu的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了2個細(xì)胞周期，再以Hoechst33258染色后，兩條姐妹染色單體就出現(xiàn)了色差，這就是姐妹染色但提到區(qū)分染色（Sister Chromatid Diffeientiation SCD）。因此，先用紫外線照射，使Brdu光解，然后以Giemsa染色時，則有色差出現(xiàn)，BB型染色單體染色淺，BT型染色單體色深。%秋水仙素溶液： 秋水仙素 5ml 生理鹽水 10ml4. 2SSC 溶液: NaCl 枸緣酸鈉 雙蒸水 1000ml：（）%Giemsa染液（以上述緩沖液配制）三、器材： 恒溫箱（37oC） 水浴鍋（4550oC） 紫外線燈（20或30W） 鋁飯盒 擦鏡紙 鐵絲架 吸管、鑷子 染片玻璃架四、操作方法： ，在加入Brdu后，其最終濃度為10181。 ，距標(biāo)本4~6cm處照射30分鐘左右，使標(biāo)本表面始終保持潤濕。 實驗八 堿性磷酸酶的顯示 一、試驗原理：本試驗是一個酶組織化學(xué)試驗，酶組織化學(xué)是在不破壞組織細(xì)胞的條件下，檢測酶的存在，定位與活性的學(xué)科，即在酶的存在，分布及其用在顯微鏡下變成可見的。如果有相同的抗原決定簇時，則會有交叉反應(yīng)。堿性磷酸酶（AKP）的顯示方法最早由Gomeri（1939）提出，現(xiàn)在這種方法稱為Gomeri法。 CoHPO4 +（NH4）2S→→（NH4）2HPO4 +CoS ↓（黑色沉淀）我們可以在顯微鏡下觀察到黑色沉淀的位置，由于以上的這些操作都是在原位進(jìn)行的，可以認(rèn)為黑色沉淀的位置就是酶所在的位置，這類方法是讓酶作用于底物而將酶顯示出來。 ：將固定好的材料，用純酒精脫水30分鐘（中間交換一次），二甲苯透明（20分鐘），用快速法把材料包埋于石蠟中（用低熔點的石蠟）。 ，直至試驗前才取出。 ，作用液要事先預(yù)熱到37oC，水浴中進(jìn)行。 。 六、觀察結(jié)果： 在顯微鏡下觀察，細(xì)胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。 。被分離的離替葉綠體是否具有光合活性，可以用不同的方法來鑒定，對染料（26—二氯酚酊糞）在光下還原作用是其中的一個方法。這樣在實驗中所需的基本儀器和藥品都必須保存在冰箱中，而且整個操作過程都應(yīng)在04oC條件下完成。 [2].1104 M ３(3,4二氯苯)1，1二甲基脲（DCMU）。 取10ml分離介質(zhì)（STN緩沖液）分兩次放入研缽中。 上清液中加入介質(zhì)5ml，混勻，再以1000rpm 離心8分鐘，棄去沉淀，留上清。 分別在兩張載片上各滴一滴加熱和未加熱的葉綠體懸浮液，并用蓋片蓋起來，在油鏡下觀察這兩種葉綠體的形態(tài)。m。六、作業(yè)： ，并繪制草圖。每一染色體含有兩條染色單體，借一個著絲點向兩端伸展的是染色體的臂，染色體的長度和著絲粒位置時染色體最重要的形態(tài)標(biāo)志，著絲粒的位置關(guān)系到染色體的形狀和兩臂的長度，在每個