17-病理學常用技術的原理及應用-文庫吧資料
2025-08-10 07:45本頁面
【正文】 增產物的原位雜交和檢測等。原位PcR(in situ PcR)技術是將PcR的高效擴增與原位雜交的細胞及組織學定位相結合，在冷凍切片或石蠟包埋組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測和定位核酸的技術。 第七節(jié)原位多聚酶鏈式反應技術 原位多聚酶鏈式反應技術是多聚酶鏈式反應(polymerase chain reactl’orl，PcR)技術的一部分。原位雜交與免疫組化染色技術相比較．IHc使用的是抗體．其檢測對象是抗原，機制是抗原一抗體的特異性結合，是蛋白質表達水平的檢測；IsH使用的是探針．遵循堿基互補配對的原則，與待檢測的靶序列結合，是DNA或轉錄(mRNA)水平的檢測。FIsH的實驗材料可以是問期細胞、分裂中期的染色體，也可以是冷凍或石蠟切片組織(圖17—6)。間接法：FISt{是以非熒光標記物標記已知DNA探針．再橋連一個熒光標記的抗體。FISH) 可以用直接法或間接法進行FIsH。操作中應注意的問題有：①對DNA—RNA雜交和RNA—RNA雜交．需進行滅活RNA酶處理，包括用0．5％o的二乙基焦碳酸鹽(diethylpyrocalbonate，【)EPC)水配制有關試劑和160～180℃烘烤實驗用器皿等；當使用雙鏈cDNA探針和(或)待測靶序列是DNA時，需進行變性處理使DNA解鏈；②雜交溫度應低于雜交體的解鏈溫度(Tm)25~(2左右；③對照實驗：原位雜交遠較免疫組化染色復雜，影響因素頗多，故對照實驗必不可少，有組織對照、探針對照、雜交反應體系對照和檢測系統的對照等，可根據具體情況選用。 (二)原位雜交的主要程序 原位雜交的實驗材料可以是常規(guī)石蠟包埋組織切片、冷凍組織切片、細胞涂片和培養(yǎng)細胞爬片等。ss、印等，這類探針的敏感性高，但有半衰期及放射性污染，成本高且耗時等缺陷，故其使用受到限制；非放射性探針標記物有熒光素、地高辛和生物素等．盡管其敏感性不如放射性標記探針，但因其性能穩(wěn)定、操作簡便、成本低和耗時短等長處，正越來越廣泛地得到應用。一般而言，探針的長度以50～30(3bp為宜，用于染色體原位雜交的探針可為1．2～1．5kb。根據所選用的探針和待檢測靶序列的不同，有I)NA—DNA雜交、DNA—RNA雜交和RNA—RNA雜交。它是用標記了的已知序列的核苷酸片段作為探針(probe)，通過雜交直接在組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測和定位某一特定靶DNA或RNA的存在。熒光標記的探針或抗體的質量將直接影響實驗的結果。 (二)LSCM對樣本的要求及其局限性 用于LscM的樣本最好是培養(yǎng)細胞樣本，如培養(yǎng)細胞涂片或細胞爬片，也可以是冷凍組織切片．石蠟包埋組織切片不適用于該技術。eSCeDCe recovery afterphotcIbleachinR．FRAP)：它利用高強度脈沖式激光照射細胞的某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的漂白．而該區(qū)域周圍的非漂白熒光分子將以一定速率向受照射區(qū)擴散，Ls(2M可直接對其擴散速率進行監(jiān)測。同時具有深度識別能力(最大深度一般為200～4()0仙m)及縱向分辨率，因而能看到較厚生物樣本中的細節(jié)。其主要部件有激光器、掃描頭、顯微鏡和計算機等。該技術的不足之處是手工操作法的技術難度大；用LCM雖然操作簡便，耗時少，取材準確，但需特殊的設備，激光器造價高。 顯微切割術的特點是可從構成復雜的組織中獲得某一特定的同類細胞群或單個細胞。將帶有細胞的。使其光路與顯微鏡聚光器的光路共軸，光斑恰好落在顯微鏡視野中心，即要切割的區(qū)域。激光捕獲顯微切割(1asel‘capture microdissection，LcM)技術的基本原理是：將組織切片放在倒置顯微鏡的載物臺上，并在切片表面覆蓋一層乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate；EVA)薄膜。染色可以用普通方法，如甲基綠、核固紅、瑞氏染液或蘇木素等，也可用免疫組化染色，如要切割霍奇金淋巴瘤組織切片上的R—S細胞時，可用cDl5或cD30單克隆抗體染色進行靶細胞示蹤。切片的厚度可為4～10斗m，冷凍切片需經甲醛或乙醇固定。再進行如PcR、PcR—SS(：P及比較基因組雜交等有關的分子水平的研究。 第四節(jié) 顯微切割技術 顯傲切割術(nLICI但電鏡技術也有其局限性，如設備昂貴、樣本制作較復雜；樣本取材少。如一些去分化、低分化或多向分化腫瘤的診斷和鑒別診斷。電鏡樣本的制備與常規(guī)病理制片不同之處有：①要求組織新鮮，選擇有代表性的區(qū)域進行小塊多點取材；②雙重組織固定，常用的化學固定劑有鋨酸、醛類固定劑和高錳酸鉀等；③環(huán)氧樹脂包埋；④半薄切片經染色進行組織定位后再切制超薄切片；⑤重金屬鹽如醋酸鈾或枸櫞酸鉛等染色。電鏡技術使病理學對疾病的認識從組織、細胞水平深入到細胞內超微結構水平，觀察到了細胞膜、細胞器和細胞核的細微結構及其病理變化，大大開闊了人們的視野，并由此產生了亞細胞結構病理學(剛hcelhalat’stnlcture pathology)，又稱超微結構病理學(ultrastr．uCtural pathology)。電子顯微鏡和光學顯微鏡的基本原理相同，不同的是光鏡的照明源是可見光，而電鏡是以電子束為光源。普通光學顯微鏡的分辨極限是0．2斗m，而目前最好的電鏡的分辨率可達0．14nm，有效放大倍數為100萬倍。 第三節(jié) 電子顯微鏡技術 1931年德國的Knoll和R。免疫組化染色已經成為病理診斷中必不可少的檢測手段。免疫組化技術可用于各種蛋白質或肽類物質表達水平的檢測、細胞屬性的判定、淋巴細胞的免疫表型分析、細胞增殖和凋亡的研究、激素受體和耐藥基因蛋白表達的檢測，以及細胞周期和信號轉導的研究等。 3．免疫組化染色技術的應用 隨著大量商品化的單克隆和多克隆抗體的出現。假陰性反應見于組織內待測抗原已被分解破壞，或抗原含量過低，或固定劑使用不當，抗體質量不佳或稀釋度不當等；反之，由于抗體與非待檢抗原發(fā)生交叉反應，或組織對抗體的非特異性吸附以及內源性
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