【正文】 水平抑制多種流感病毒復(fù)制，包括H274Y耐藥毒株。圖 7[44] ；為了克服不利的藥動學(xué)性質(zhì)引發(fā)的耐藥問題，Schade[47]也對奧司他韋母環(huán)5位氨基的取代進行了探討。2014年，在對奧司他韋母環(huán)5位氨基進行異硫脲取代時，Pinto課題組意外得到了螺環(huán)化合物K（如圖 8），其對HK1流感病毒的有效濃度為106～107 M。Pinto課題組[44]以奧司他韋為先導(dǎo)化合物，用帶羥基側(cè)鏈的三氮唑替換奧司他韋骨架5位上的氨基，得到了以化合物J為代表的Ⅰ類選擇性的NAI（Ki = ⅹ109 ～ ⅹ1010 M）。2006年，隨著Russell[43]等對NNN8的結(jié)構(gòu)解析，人們發(fā)現(xiàn)：Ⅰ類NA催化區(qū)2號亞位點附近連接著開放的“150腔”；然而，Ⅱ類NA中“150LOOP”處于封閉構(gòu)象，使得Ⅱ類NA活性結(jié)合區(qū)旁邊不存在該“150腔”，如圖 7所示。通過Hanessian和Bhatt的工作，我們發(fā)現(xiàn)NA催化區(qū)2號亞位點的氫鍵相互作用對于NAI的活性非常重要。2012年，Bhatt[42]繼續(xù)對該位點改造，通過羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙基取代的對比，發(fā)現(xiàn)還是羥基取代（化合物I）的活性最高(IC50 = 181。圖 6列出了奧司他韋與NA催化區(qū)（以N8為例）結(jié)合模式，我們將結(jié)合區(qū)分為4個亞位點。常見的N2亞型（主要為H3N2）耐藥突變?yōu)镋119V、R292K突變，但是H274Y突變并不能導(dǎo)致N2亞型對奧司他韋的耐藥[37, 38]。目前，從人、豬、禽類中分離的NAI耐藥病毒株，包括了除N4亞型之外所有甲型流感病毒亞型以及乙型流感病毒。目前臨床使用較少的NAI還有在日本應(yīng)用的帕拉米韋（Peramivir）以及拉尼那米韋（Laninamivir），其中拉尼那米韋屬于目前唯一長效NAI。該化合物于1999年被FDA批準(zhǔn)用于臨床。但是，其口服生物利用度低，目前臨床主要使用其吸入劑型。（5）NA 1967年，一種神經(jīng)氨酸酶類似物（DANA）被Meindl等合成，然而，其對NA的抑制活性并不顯著，未能應(yīng)用于抗流感治療。靶向HA的抗流感化合物，根據(jù)機制不同可分為兩類：一類是阻止HAl與宿主細(xì)胞膜表面SA受體結(jié)合的黏附抑制劑，這類以fludase（DAS181）為代表，其是一種新型唾液酸酶融合蛋白，目前處于Ⅱb期臨床（美國）；另一類是阻斷HA2介導(dǎo)的膜融合過程的融合抑制劑（抑制低pH誘導(dǎo)的HA構(gòu)象轉(zhuǎn)化），這是人們研究較早的一類抑制劑，包括1997年報道的以BMY27709為代表的水楊酰胺類、1998年報道的以stachyflin為代表的司他弗林類化合物。HA2的N端插入胞內(nèi)體膜，每三分子的HA2即形成六螺旋束形“融合孔”，使得病毒膜與胞內(nèi)體膜融合，病毒基因組通過融合孔進入細(xì)胞質(zhì)。同時，針對A/M2及BM2蛋白進化高度保守區(qū)HXXXW開發(fā)抑制劑，有望得到對甲型、乙型流感均有效的藥物[32]。但是，這類藥物能夠促進外呼吸道擴張從而增加攝氧量，使得其在抗流感中仍然具有重要價值。圖 5 NP及HA的抑制劑（3）M2 金剛烷胺、金剛乙胺為兩個最具代表性的M2離子通道抑制劑，僅對甲型流感有效。2012年，丁克課題組[29]通過對nucleozin的改構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了化合物G（如圖5），其針對各種H3N～ μM，對金剛烷胺耐藥的A/WSN/33(H1N1)、奧司他韋耐藥的A/WSN/1933(H1N1,274Y)病毒株也有一定效果。不同亞型的A型流感病毒尾環(huán)的組成氨基酸進化中高度保守，其上30個氨基酸殘基的單個突變就可導(dǎo)致NP聚合能力的完全喪失，因此，尾環(huán)上的結(jié)合口袋成為NP靶向抗流感藥物的潛在靶點。NP含有一種胞漿聚集信號，通過與絲狀肌動蛋白相互作用，導(dǎo)致NP在病毒感染后期滯留在胞漿。（2）NP 核蛋白占病毒蛋白總量的30％，其N端含有一個RNA結(jié)合區(qū)域以及兩個核蛋白核蛋白相互作用區(qū)域。同時，T705對NAI、M2I耐藥病毒株也有效[26]。T705是一種前藥，代謝活化后，通過競爭性結(jié)合GTP抑制流感病毒RdRP。M。利巴韋林（Ribavirin）和Favipiravir（T705）是兩個核苷類的RdRP抑制劑（圖 4），～37 181。2014年，Pagano[25]報道了兩個化合物（如圖 4所示化合物E、F），其抑制A/H1N1亞型AIV的IC50均為1 181。2013年，Massari[24]報道了化合物D，也是PACPB1N相互作用抑制劑，結(jié)構(gòu)如圖 4所示，其對A/H1N1亞型AIV的EC50一般為20 181。2012年，Muratore[23]通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)圖 4所示化合物C，其可以干擾PA、PB1蛋白正確結(jié)合，其抑制病毒斑形成的ED50為20 181。另外，PA亞基124～139及186～247兩個氨基酸殘基區(qū)域存在兩個核定位（NSL）信號，這與PB1亞基穿核運輸及核內(nèi)聚集相關(guān)[21]。其次，PA亞基為磷酸化蛋白，1～247位氨基酸殘基區(qū)域是其介導(dǎo)蛋白質(zhì)水解的功能區(qū)，其水解活性與聚合酶活性呈正相關(guān)[19]。圖4 RdRP的抑制劑PA也是3P復(fù)合體一個非常重要的亞基。如圖4所示，化合物B為近年報道的靶向PB2的化合物，其抑制A/ 181。第三，PB2亞基能夠增強聚合酶復(fù)合物的穩(wěn)定性，這可能是PB2亞基能夠增強流感病毒對外界溫度適應(yīng)性的原因[13]。首先，PB2亞基318483位氨基酸殘基區(qū)域能夠與宿主mRNA引物帽結(jié)構(gòu)結(jié)合[12]，從而啟動轉(zhuǎn)錄過程。M[11]。其構(gòu)象的轉(zhuǎn)換也是PB2帽子結(jié)合位點與內(nèi)切酶活性位點激活的一個原因[10]。PB1位于3P復(fù)合體的核心，其N端和C端分別與PA亞基的C端、PB2亞基N端相連，形成穩(wěn)定蛋白復(fù)合物。感染早期階段，RdRP以vRNA為模板合成mRNA，具有轉(zhuǎn)錄功能；病毒感染晚期，RdRP構(gòu)象轉(zhuǎn)變，以vRNA為模板合成互補的cRNA，再以合成的cRNA為模板合成vRNA,從而實現(xiàn)復(fù)制功能。針對流感病毒自身功能蛋白的靶點及抑制劑該類化學(xué)藥物根據(jù)病毒作用部位不同，可分為三大類，分別針對病毒核心（RdRP、NP）、病毒基質(zhì)蛋白（M2）、病毒包膜突觸（HA、NA），下面就它們的抑制劑作簡單介紹。圖3 蛋白酶及VATPase抑制劑（2）囊泡質(zhì)子ATP酶（VATPase） 選擇性VATPase抑制劑通過升高前溶酶體內(nèi)部pH，從而抑制HA從非融合構(gòu)象向融合構(gòu)象的轉(zhuǎn)化，進而實現(xiàn)病毒復(fù)制的抑制。然而，在一般的甲型流感病毒中，蛋白酶剪切位點表達(dá)的是單個精氨酸殘基，只能被內(nèi)蛋白酶識別，同時這種蛋白酶僅在鳥類腸道以及鳥類與哺乳動物的呼吸道中表達(dá)，極大地限制病毒在宿主體內(nèi)的傳播[8, 9]。（1）蛋白酶 前體蛋白HA0剪切位點的性質(zhì)決定了能夠剪切HA0的宿主蛋白酶類型，直接影響病毒嗜組織性和致病力。總的來說，目前的抗流感化學(xué)藥物有兩個大的研究方向，分別針對流感病毒本身功能蛋白和宿主細(xì)胞潛在靶點?？沽鞲胁《景悬c及其抑制劑預(yù)防和治療流感，通常采用疫苗和抗流感化學(xué)藥物。在非結(jié)構(gòu)性的核輸出蛋白NEP/NS2及基質(zhì)蛋白M1介導(dǎo)下，核內(nèi)形成的子代vRNP被轉(zhuǎn)運出宿主細(xì)胞核進入細(xì)胞漿，經(jīng)裝配形成成熟病毒顆粒。RdRP以及NP對流感病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制具有重要意義。與此同時，非糖基化基質(zhì)蛋白M2離子通道被激活，形成進入細(xì)胞內(nèi)膜的內(nèi)向質(zhì)子流，引發(fā)基質(zhì)蛋白M1與vRNP的解離。接著，在受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用下，結(jié)合于宿主細(xì)胞表面的病毒進入宿主細(xì)胞并形成胞內(nèi)體（endosome）。流感病毒感染及增殖過程圖2 流感病毒感染及增殖機制[4]如圖2所示，流感病毒感染及增殖過程可大致分為黏附→內(nèi)吞→融合→去包膜→入核→vRNA合成→蛋白合成→出核→組裝→出芽→釋放等階段。圖1 甲型流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖[3]三種類型流感病毒的宿主范圍也是有區(qū)別的：甲型流感病毒能夠感染哺乳類動物（人、豬、馬等）和禽類，乙型流感病毒主要在人類和豬間傳播，丙型流感病毒只在人類傳播。乙型流感病毒表