實(shí)驗(yàn)課-制藥工程生化原理與制備實(shí)驗(yàn)指doc-文庫吧資料
2024-07-28 04:38本頁面
【正文】 離電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為前沿標(biāo)記。加樣時，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。（三）加樣加樣體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10—15μL。凝膠聚合約需30min，小心拔出梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去殘余水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面。SDSPAGE 分離膠配制方法2. 凝膠板的制備按表SDSPAGE分離膠配制方法配制10ml 10%濃度的膠，按SDSPAGE濃縮膠（5%Acrylamide）配方表配制5ml5%濃縮膠，再向兩塊玻璃板的縫隙內(nèi)加水，待分離膠凝固后，把水倒出，用濾紙把水吸干。（二）配膠及凝膠板的制備1. 配膠根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。4） 將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。各部分按下列順序組裝：1） 裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。電泳槽由上貯槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋冷凝管組成。五、操作（一）安裝夾心式垂直板電泳槽夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。5. 染色液 考馬斯亮藍(lán)R250 ，加上述固定液250ml，過濾后應(yīng)用。8) 2%瓊脂（糖）粉稱瓊脂（糖）2g，加100ml上述電極緩沖液，4℃貯存。6) 10%過硫酸銨（AP）稱AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶內(nèi)4℃貯存。4℃貯存，用前稍加溫使SDS溶解。3) 凝膠貯液稱Acr30g，加重蒸水至100ml，過濾后置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存可用1—2個月。 d．使用前將25 ul的2ME加到每小份中。 ml b．加去離子水溶解后定容至5 ml。 g 溴酚藍(lán)（BPB） 1 M Tris?Cl (pH )甘油5% (W/V)SDS （電泳級）% (W/V)2) 5樣品溶解液（上樣液）組分濃度：250 mmol/L因此，為了測得真實(shí)和完整的蛋白質(zhì)分子量，通?？刹捎枚喾N方法進(jìn)行測定和相互驗(yàn)證。當(dāng)然這也使得SDS—PAGE特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測定。因此，對于這一類的蛋白質(zhì)，SDS—PAGE測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。表1 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系凝膠濃度交聯(lián)度分子量范圍5%%25,000—200,00010%%10,000—70,00015%%10,000—50,000由于SDS—PAGE具有設(shè)備簡單、快速，分辨率和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)等方面。在相同條件下只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)的電泳遷移率，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其近似分子量。蛋白質(zhì)分子量在10，000—200，000之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，可用下列公式表示：上式中，為蛋白質(zhì)分子量；為常數(shù)；為斜率；為相對遷移率（即蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以示蹤染料遷移距離）?；谏鲜鰞煞N情況，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是與橢圓棒的長度有關(guān)，也就是只與蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，所以生成的蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)所帶凈電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷。十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS）是陰離子表面活性劑，它在水溶液中，以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能限制蛋白質(zhì)大分子的擴(kuò)散運(yùn)動，具有良好的抗對流作用。聚丙烯酰胺凝膠由于富含酰胺基，故它是穩(wěn)定的親水凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, 簡稱PAGE）。2．掌握SDS—PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的操作方法。（6） 將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1618 h，量取各抑菌圈直徑（SH、SL、UH、UL），以毫米為單位。（4） 鑷子火焰滅菌3次，然后夾取4個牛津杯垂直放置在平板中標(biāo)志附近（注：勿使鋼管陷入培養(yǎng)基內(nèi)，各小杯之間盡量等距）。用無菌吸管吸取 1ml芽胞懸液，加入到200ml恒溫于50℃的上層培養(yǎng)基中搖勻，迅速以無菌吸管吸取5ml，注入到底層培養(yǎng)基上，鋪平待凝。四 實(shí)驗(yàn)方法（1） 取無菌平皿，加入20ml底層培養(yǎng)基，凝固后作為底層。（3）抗生素：抗生素檢品及標(biāo)準(zhǔn)品（高劑量、低劑量，高劑量與低劑量之比為2:1）。三 實(shí)驗(yàn)材料 材料和儀器（1）細(xì)菌：短小芽胞桿菌[CMCC（B）63202的芽胞懸液。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的抑菌圈。ant
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