【正文】 連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,分離膠與濃縮膠中均含有 TEMED和 AP,試述其作用 ? 4. 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘 ? 實驗五 等點聚焦測定蛋白質 的等電點 【 實驗目的 】 1. 掌握凝膠等電聚焦的基本原理。測得待測蛋白質的遷移率后，由曲線上即可查出其分子量。 6. 進樣：將處理好的樣品 10181。l TEMED ， 混勻 ） ， 將 配 好 的 濃 縮 膠 立即倒入凝膠槽 （ 插入梳子不溢出為宜 ） ，插入梳子； 對于不同分子量樣品建議使用的凝膠濃度 分 子 量 膠 濃 度（ %） 104 20~30 14 104 15~20 4 1041 105 10~15 1 1055 105 5~10 5 105 2~5 4. 待膠凝固后，拔出梳子，加入電泳緩沖液（淹沒膠，但不高于電泳槽）； 5. 樣品處理：取標準蛋白或樣品 1020181。 3. 將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內，至凝膠槽高三分之二處，加 1~2cm高的蒸餾水密封。l AP和 10181。 12. 固定液：取 50%甲醇 454mL，冰醋酸46ml混勻。 10. 標準蛋白（次高分子量）。 8. 染色液： g 考馬斯亮蘭 R250，溶于 500ml固定液中，混勻。 6. 過硫酸銨（ AP）溶液： 1gAP溶于10ml ddH2O中（要求現(xiàn)用現(xiàn)配）。 4. 電極緩沖液： 3 g Tris、 g甘氨酸、 1g SDS， ddH2O定容至 1000ml。 2. TrisHCl緩沖液： gTris加入 50ml ddH2O使之溶解，再加入 3ml 1M HCl溶液，混勻后在 pH計上調 pH至 ，最后加 ddH2O定容至 100ml。也可以用相關分析軟件得出回歸方程并計算出結果。將已知相對分子質量的標準蛋白的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可得到一條標準曲線。 SDSPAGE測定蛋白質分子量及染色鑒定。 實驗四 SDS聚丙烯酰胺（ PAGE）凝膠電泳測定蛋白質分子量 【 實驗目的 】 SDSPAGE測定蛋白質分子量的原理。 暫不用時可將其倒出 ， 浸于 1%正丁醇的緩沖液中 ， 以防霉變 。 由于純化的白蛋白仍然結合有少量膽色素等物質 ， 故肉 眼可 見一層淺黃色的成分被 mol/L NH4Ac 緩沖液洗脫下來 ， 大約改用 mol/L NH4Ac 洗脫約 4 ml時 ，即可試出有蛋白質白色混濁 ， 立即連續(xù)收集 3管 ，每管 10滴 ， 此即為純化的白蛋白液 ， 取其中蛋白質濃度高的兩管留作含量測定和純度鑒定用 （ 視收集量和蛋白質的濃度可選擇用 30%PEG濃縮 ） 。 8. 純化白蛋白 取上一實驗所保存溶液 （ 白蛋白 ） , 再對 PBS（ ） 透析 24hr， 更換數(shù)次 PBS， 使蛋白質溶液中 pH為 ；透析后白蛋白樣品上柱后 ， 改用 mol/L NH4Ac 緩沖液 （ ）洗滌 ， 流出約 30 ml（ 其中含 α–及 β–球蛋白 ） 后 ， 將柱上的緩沖液面降至與纖維素床表面平齊 。 4. 0. 1N HCl和 NaOH 5. Nessler試劑 6. 1cm 20cm層析柱 7. 黑、白比色板 【 操作步驟 】 1. DEAE32－纖維素的活化處理： (1)取 DEAE32－纖維素 （ DEAE32－纖維素的量（干重），一般按樣品的蛋白質量計算，大約是蛋白質量的 10~15倍）懸于 NaOH溶液中，浸泡過夜，用 300ml錐形瓶盛裝； (2)次日，在布氏漏斗上輕吸過濾，用蒸餾水洗，直至 ，抽干； (3)用 HCl浸泡 30min，用蒸餾水洗凈，直至，抽干； (4)PBS（ ）浸泡 3hr； (5)傾去微細顆粒（浮懸），加入 PBS（ 5M ）使容積為沉淀體積的 ； 2. 關閉柱的出口，向柱內加入 1/3體積的 PBS （ ） ,將 DEAE32－ cellulose懸浮液 用玻棒引流連續(xù)倒入柱內，當交換劑沉積到底部時，打開流出口，讓緩沖液緩慢流出，再倒入更多的懸液，直至整個用量加完為止； 3. 將柱與儲液瓶（內盛同樣 PBS）連接，流洗幾個柱體積的緩沖液，使柱床穩(wěn)定，并使得流出液 pH為 ； 4. 純化 γ球蛋白：取實驗 3所保存溶液 （ γ球蛋白 ） ， 再對 PBS（ ） 透析 1224hr， 更換數(shù)次 PBS ， 使蛋白質溶液中 pH 為 ； 5. 將透析后的粗提 IgG樣品緩緩加在柱床頂部 ，打開出水口 ， 待樣品全部進入柱床后 ， 緩慢流入 PBS（ ） ， 調整流速至 ， 開始用Eppendorf管收集洗脫液 ， 每管 1ml， 先用磺酰水楊酸檢測有無蛋白質流出 （ 蛋白質遇磺酰水楊酸顯白色 ，故用黑色比色板 ） ， 待蛋白質流出后 ， 迅速收集蛋白液 （ 視收集量和蛋白質的濃度可選擇用 30%PEG濃縮 ） 。 【 試劑與器材 】 1. 20%磺酰水楊酸 2. DEAE32－ cellulose 3. PBS（ ）：取 Na2HPO4 、 NaH2PO4 ，用酸度計檢查 pH值應為。利用這個反應先將要分離的混合物在一定 pH 的溶液中解離，而后流經(jīng)固定相，使之與固定相上的可解離基團進行離子交換，吸附于固定相上，凡不能進行交換吸附的成分，則流出層析柱外。 實驗三 離子交換層析法分離 血清白蛋白 【 實驗目的 】 通過對白蛋白純化的實驗，培養(yǎng)學生綜合運用離子交換層析手段分離蛋白質純品的技能。然后按預處理過程將 A50 再處理一遍即達再生。長期保存時應貯于 40℃ 冰箱。并以 A 280 為縱坐標，繪制洗脫曲線。并控制流速 ， 4 滴 /min. 5 ．收集 開始洗脫的同時就以試管進行收集；每管收集 4ml. 共收集 10 ～ 15 管。 4 ． 加樣及洗脫 啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾 ， 使柱中液體緩慢滴出 ， 當柱面液體與柱面相切時 ， 立即關閉出水口 ， 以毛細滴管沿柱壁加入樣品（ 血清 ， 體積應小于床體積的 2% ， 蛋白濃度以＜ 100mg 為宜 ） 。 3 ． 平衡 啟開出水口螺旋夾 ， 控制流速 4 滴 /min ， 使約 2 倍床體積的洗脫液流出 。待 A50 凝膠沉降 2 ～ 3cm 高時，開啟出水口螺旋夾，控制流速 1ml/min ，同時連續(xù)倒入糊狀 A50 凝膠至所需高度。 2 ．裝柱 （ 1 ）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。 【 試劑與器材 】 1. DEAESephadex A50 2. 3. 4. () 5. ％ NaN 3 6. PEG 7. 無水乙醇 8. 紫外分光光度計 9. 1cm 20cm 玻璃層析柱 10. 自動部分收集器 【 操作步驟 】 1 ． DEAESephadex A50 預處理 稱 DEAESephadex A50 （ 下稱 A50 ） 5g ， 懸于 500ml 蒸餾水內 ， 1h 后傾去上層細粒 。 pH ～ 的環(huán)境中。用 NaOH 將 Cl 型轉變?yōu)? OH 型后，可吸附酸性蛋白。 容量瓶編號 牛血清蛋白溶液 蒸餾水 蛋白質濃度 mg/ml 1 稀釋至刻度 2 稀釋至刻度 3 稀釋至刻度 4 稀釋至刻度 5 稀釋至刻度 6 稀釋至刻度 2. 未知樣品蛋白質濃度的測定 取樣品 ，加雙縮脲試劑 勻，于 540nm處測定其吸光度，對照標準曲線，求出蛋白質濃度。 5. 吸量管（ 1ml， 2ml， 5ml） 6. 721型分光光度計 【 操作步驟 】 1. 繪制標準曲線 取 6只試管編號，按下表加入試劑，即得 6種不同濃度的蛋白質溶液。此試劑可長期保存。 【 試 劑 和 器 材 】 1. 2. 容量瓶 10ml（ 6） 3. 試管 15cm（ 8） 4. 雙縮脲試劑：溶解 （ CuSO4 5H2O）溶于 15ml水中，在 100ml容量瓶中加入 30ml 濃氨水、 30ml冷蒸餾水和 20ml飽和氫氧化鈉，搖勻，室溫 12h定容 100ml，搖勻備用。在堿性溶液中蛋白質與 C u2＋形成紫紅色絡合物，在540nm波長處有最大吸收。 【 思考題 】 Folin酚法測定蛋白質濃度的原理是什么？ 影響 Folin酚法測定蛋白質濃度的準確性的因素有那些？ 四、雙縮脲法 【 實驗目的 】 了解雙縮脲法測定蛋白質濃度的原理和方法。于 660nm比色，做標準曲線。 臨用前氫氧化鈉滴定 ， 用酚酞做指示劑 ， 據(jù)滴定結果 ， 將試劑稀釋至 1mol/L的酸 ， 冰箱保存 。 將 50ml儲備液 1和 1ml儲備液 2混合為溶液 A,混合后一日有效 。首先在堿性溶液中形成銅 蛋白質復合物，后與磷鉬酸