【正文】 洗滌緩沖液沖膜3次，每次5分鐘。完成后的NC膜用去離子水沖洗，置于3 %脫脂奶粉中，室溫封閉1小時(shí)，用洗滌緩沖液沖膜3次，每次5分鐘。3. 組裝電轉(zhuǎn)膜三明治，順序?yàn)椋赫龢O，海綿，whatman濾紙，NC膜，非變性聚丙烯酰胺凝膠，whatman濾紙，海綿，負(fù)極。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，方法如下：1. 將非變性聚丙烯酰胺凝膠浸泡于電轉(zhuǎn)膜緩沖液中，同時(shí)將兩張同樣大小的whatman濾紙及兩塊海綿浸泡于緩沖液中。分別將BSA及兩種方法制備的人工免疫原各10 μL （1mg/mL）與等體積的loading buffer混合后上樣，積層膠使用100V電壓，分離膠120V電壓?？贵w效價(jià)及參考工作濃度測定采用非競爭性間接ELISA法。使用辛酸－硫酸銨法純化單克隆抗體，SDSPAGE鑒定。取抗體分泌陽性細(xì)胞，用有限稀釋法做克隆化[42]，以獲得可穩(wěn)定分泌特異性mAb的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。SP2/0細(xì)胞（2107）與免疫鼠脾細(xì)胞（1108）按1:5的比例混合[42]，加入PEG1500融合，操作按PEG使用說明進(jìn)行。陽性孔中，多克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)為其效價(jià)。7. 讀數(shù)：立即用吸水紙吸干酶標(biāo)板底部，將其置于酶標(biāo)儀上，450nm波長下，以沒有反應(yīng)的空行為空白對照，測各值OD值，每組數(shù)據(jù)都以三次重復(fù)測得的平均值為準(zhǔn)。5. 顯色：現(xiàn)配A液、B液，每孔各加50 μL，37℃溫育10min。4. 加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 μL按1：5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃溫育1小時(shí)。37℃溫育1小時(shí)。用洗滌液緩沖液洗滌三次，拍干。用洗滌液緩沖液洗滌三次，拍干。采用非競爭性間接ELISA法測定多克隆抗體的效價(jià)。以后間隔兩周追加免疫一次，方法為腹腔注射100 μg HaptenBSA（溶于100 μL PBS，不加福氏佐劑），共追加免疫5次。（2）人工抗原免疫原性鑒定用人工免疫原對8周齡BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，每種免疫原免疫三只小鼠。將上述溶液置于U3310紫外分光光度計(jì)（HITACHI）中進(jìn)行波長掃描，掃描波長200~300nm，光程10 mm。 人工免疫原及檢測抗原的鑒定（1）紫外吸收光譜對偶聯(lián)物進(jìn)行分析用PBS溶解BSA、OVA、HaptenBSA及HaptenOVA， mg/mL。離心后，將上清液在電磁攪拌條件下， mg BSA或37 mg OVA的4 mL （PBS，）中，常溫下繼續(xù)攪拌2小時(shí)，4℃下對2 L超純水透析兩天，凍干。其中Hapten與BSA的偶聯(lián)物（HaptenBSA）為人工免疫原，Hapten與OVA的偶聯(lián)物（HaptenOVA）為人工檢測抗原。用1M ，室溫?cái)嚢?小時(shí)。圖21半抗原的合成Figure 21 Synthetic routes for Hapten（1）混合酸酐法制備人工抗原取O,O二乙基O（4羥基3甲基苯） mg、 μL及氯甲酸異丁酯4 μL， mL DMF（分子篩脫水）中，常溫下避光攪拌40分鐘。再將產(chǎn)物（2）318 mg溶于60 mL乙醇，電磁攪拌下加入25 mL1 M KOH，室溫下繼續(xù)攪拌30分鐘；加入30 mL 1 N HCl，50 mL乙酸乙酯萃取，20mL 1 N HCl洗滌有機(jī)層，無水硫酸鎂干燥，待溶劑蒸發(fā)干凈后，殘余上柱層析（硅膠，己烷:乙酸乙酯:乙酸=200:100:8， TLC Rf ）。將上述產(chǎn)物（1）。Western免疫印跡主要試劑：（1）轉(zhuǎn)膜緩沖液： g Trisbase， g甘氨酸，200 mL甲醇，加去離子水定容至1 L，4℃貯存；（2）洗滌緩沖液：同ELISA；（3）顯色液：增敏二氨基聯(lián)苯胺（DAB）。 溶液系統(tǒng)ELISA用主要試劑：（1）包被緩沖液： mol/L，pH 的碳酸鹽緩沖液； （2）洗滌緩沖液：PBST（ %Tween20的磷酸鹽緩沖液，下同）；（3）封閉液：1 g BSA 溶于100 mL洗滌緩沖液；（4）抗體稀釋液為PBST；（5）底物緩沖液：pH 的磷酸檸檬酸緩沖液；（6）顯色液A液：8 μL 3 %H2O2 加入5 mL底物緩沖液中，混勻，B液：1 mg四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶于1ml無水乙醇，加底物緩沖液5mL；（7）終止液：2 mol/L H2SO4。單克隆抗體與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點(diǎn)：1. 單一特異性，與一個(gè)抗原決定簇反應(yīng)；2. 可重復(fù)性，能夠提供完全一樣的抗體制劑；3. 一經(jīng)制出，可無限量地供應(yīng)；4. 生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原；5. 能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。1975年Kohler和Milstein首創(chuàng)了小鼠B淋巴細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體技術(shù)，基本原理是：分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞不能在體外生長，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。反應(yīng)式為：活潑酯法是對碳二亞胺法的改進(jìn)，由于消除了碳二亞胺對蛋白質(zhì)的直接作用，從而避免了蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)[41]。為了使上述免疫分析方法達(dá)到靈敏度高、特異性強(qiáng)的要求，前人對半抗原和蛋白質(zhì)鏈接方法進(jìn)行了大量研究，建立了重氮化法、戊二醛法，混合酸酐法以及活潑酯法等。此方法首先發(fā)展于人工抗原的制備研究。免疫分析檢測法的核心是抗原抗體反應(yīng)，由于有機(jī)磷農(nóng)藥屬半抗原，不具有免疫原性，它必須與其它大分子物質(zhì)結(jié)合后才具有免疫原性，才能用于制備抗體。其后，Johnson[36]以及Alcocer[37]等人在抗體的敏感性方面做了重要改進(jìn)，但是對分析物的反應(yīng)缺乏一致性。如何將單克隆抗體檢測范圍擴(kuò)大，從而直接檢測出具有共同基團(tuán)的一類農(nóng)藥，逐漸引起研究者的關(guān)注。55西北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章 抗原合成與單克隆抗體的制備大多數(shù)對農(nóng)藥的免疫化學(xué)檢測法都只針對一種特定的農(nóng)藥。從上述文獻(xiàn)報(bào)道中可以得出這樣的結(jié)論，膠體金免疫層析檢測技術(shù)具有敏感、快速、穩(wěn)定等特點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)正是我們在研究化學(xué)農(nóng)藥多殘留檢測中所需要和追求的。對于小分子化合物的膠體金免疫層析技術(shù)目前已在檢測毒品方面得到廣泛的應(yīng)用，并已初步應(yīng)用在食品安全以及農(nóng)藥檢測方面。我國對膠體金免疫層析技術(shù)的研究報(bào)告最早發(fā)表于1996年，陳捷平等[33]報(bào)道采用雙單克隆抗體的免疫層析一步法檢測無需分離步驟，可在2~5分鐘內(nèi)得到結(jié)果，最低檢測限在25 IU/L，方便迅速。整個(gè)檢測過程時(shí)間不到10分鐘，可檢測到的蓖麻毒素的濃度為50 ng/mL。這項(xiàng)性質(zhì)顯著縮短了檢測時(shí)間，并且可以方便地進(jìn)行現(xiàn)場檢測。與熒光標(biāo)記物和酶標(biāo)記物相比，膠體金更加穩(wěn)定，并且不需要諸如孵育、洗板、酶反應(yīng)等一系列耗費(fèi)時(shí)間的程序。Faulk [29]把膠體金引入免疫化學(xué)。且不影響其生物活性。顏色呈桔紅色到紫紅色，具有高電子密度、介電特性和催化作用。目前，在眾多標(biāo)記物中，膠體金越來越受到研究者的青睞。免疫層析試紙法作為一種方便、快速、低成本的檢測方法，已用于許多生物學(xué)標(biāo)記物的定性檢測。許艇等（2004）[27]成功制備氨基甲酸酯類殺蟲劑—甲萘威mAb， ng/mL， % %；與滅多威、 %。顏春榮等（2003）[25]利用氟蟲腈類似物FH作為半抗原，制備mAb， ng/mL， ng/mL與定蟲隆、三氟氯氰菊酯、氟樂靈、 %。王剛垛等（1995）[23]，用人工抗原E600BSA免疫BALB/c小鼠，成功的建立了能分泌抗對氧磷mAb的雜交瘤細(xì)胞株。劉長武等（1992）[21]首先報(bào)道研究了殺蟲劑對硫磷的抗體。據(jù)《中國計(jì)量》報(bào)道[20]，2005年12月24日，“十五”國家重大科技專項(xiàng)“食品安全關(guān)鍵技術(shù)”課題“農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究”通過了由國家質(zhì)檢總局科技司和科技部農(nóng)村與社會發(fā)展司組織的有關(guān)專家的驗(yàn)收，建立了糧谷、茶葉、果蔬、果汁等農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、有機(jī)雜環(huán)類等150種以上的農(nóng)藥殘留量檢測方法31個(gè)；成功研制開發(fā)出酶抑制法、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法等農(nóng)藥殘留快速檢測試紙條、速測卡、試劑盒共計(jì)24個(gè)。在美國有關(guān)官方機(jī)構(gòu)，如環(huán)境保護(hù)署（EPA），農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)司（FSIS—USDA）和AOAC已制免疫學(xué)檢驗(yàn)商品試劑盒評定和認(rèn)可的建議準(zhǔn)則[19]。以此為基礎(chǔ)已研制出幾十種農(nóng)藥的酶免疫試劑盒，包括有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、硫代氨基甲酸酯類、有機(jī)氯類、三嗪類、擬除蟲菊類及酰胺類等。（2006）[18]以抗異硫磷的mAb建立了ELISA， ng/mL。McAdem和Hill （1992）[16]制備了殺蟲螟mAb，對谷物中的農(nóng)藥殘留量的檢測線性檢測范圍達(dá)100～20000 ng/mL。Hunto和Wie （1982） 分別報(bào)道了對硫磷和除蟲脲的酶免疫分析（EIA）檢測。Centeno和Johnson (1967) 有關(guān)制備兔抗滴滴涕和馬拉硫磷抗體的報(bào)道，被認(rèn)為是免疫學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用于農(nóng)藥分析的標(biāo)志[16]。世界糧農(nóng)組織(FAO)已向許多國家推薦此項(xiàng)技術(shù)。免疫分析是一種以抗原－抗體相互識別為基礎(chǔ)的，靈敏、簡便和快速的分析方法，被認(rèn)為是21世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的檢測分析技術(shù)。生物傳感器已在環(huán)境監(jiān)測、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在以往的研究中，免疫傳感器被用于分析包括農(nóng)藥分子在內(nèi)的多種有毒物質(zhì)和污染物。免疫傳感器將抗原（或抗體）固定在載體上，可以很方便地與未反應(yīng)的抗體（或抗原）分離，利用目標(biāo)化合物與抗體的特異性結(jié)合，并利用轉(zhuǎn)移器將這種特性結(jié)合轉(zhuǎn)化成特定形式的反應(yīng)信號，通過監(jiān)視器把這些特殊信號變成可視數(shù)據(jù)，從而使免疫測定法自動(dòng)化和小型化。Fernando[12]即采用光尋址電位型傳感器測定了有機(jī)磷類農(nóng)藥，生物敏感材料為鰻魚乙酰膽堿酯酶，可檢測出10 mmol/L的馬拉松和惡蟲威，對其它農(nóng)藥如久效磷、百治磷、敵敵畏、速滅磷等檢測濃度更高些。酶的抑制作用還可通過pH的測定進(jìn)行檢測，pH值的變化反映為酶活性（如產(chǎn)生的醋酸量）的變化。酶生物傳感器在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，檢測有機(jī)磷的生物傳感器是基于乙酰膽堿酯酶被一種或幾種分析物的抑制作用進(jìn)行檢測。根據(jù)生物敏感元件的不同，生物傳感器有酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、壓電傳感器、納米傳感器以及液晶型化學(xué)傳感器等多種類型[10]。生物傳感器通常指由生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合，對特定種類化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。迄今應(yīng)用到農(nóng)藥領(lǐng)域的免疫分析方法除了傳統(tǒng)的放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、發(fā)光免疫分析等外，還出現(xiàn)了流動(dòng)注射免疫分析、免疫傳感器技術(shù)等新方法。利用標(biāo)記免疫分析技術(shù)的原理對農(nóng)藥進(jìn)行檢測和分析的各種方法統(tǒng)稱為農(nóng)藥免疫分析。Roda等[8]采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測了對氧磷、涕滅威等有機(jī)磷農(nóng)藥，、 μg/L。pH值、試劑濃度等對發(fā)光強(qiáng)度也有很大的影響。其中魯米諾是最有效的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之一。李元光等成功研制了有機(jī)磷農(nóng)藥現(xiàn)場快速檢測儀，該儀器響應(yīng)時(shí)間為3 min，對敵敵畏、～ μg/～ μg/mL[6]。近年來，酶抑制技術(shù)進(jìn)入了開發(fā)速測與應(yīng)用的新階段，美國堪薩斯研究所開發(fā)出一種稱為農(nóng)藥檢測器（Detector）的“酶片”（Enzyme Ticket），該酶標(biāo)簽對乙酰膽堿酯酶的抑制劑靈敏，可用于測定水中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥，～10mg/kg[5]。通過酶抑制率判定蔬菜、果品及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的存在情況。該法無須昂貴的儀器，操作簡便快速，但靈敏度較差，重復(fù)性、回收率還需要進(jìn)一步的提高。（1）酶抑制法酶抑制法是一種相對成熟的快速檢測技術(shù)，適合現(xiàn)場檢測及大批樣品的篩選。（3）高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法（HPLC）可以分離及檢測極性強(qiáng)、分子量大或離子型農(nóng)藥，尤其對不易氣化或受熱易分解的化合物更能顯示出它的突出優(yōu)點(diǎn)。其中，氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）得到了廣泛的應(yīng)用[4]。我國食品理化檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)方法采用了氣相色譜檢測有機(jī)磷農(nóng)藥，檢出限為1ng[3]。（2）氣相色譜法（GC）氣相色譜法（GC）具有高選擇性、高分離效能、高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最多的方法，占有關(guān)色譜法報(bào)道的70%以上。TLC通過使用特殊的顯色劑觀察斑點(diǎn)顏色以及使用Rf值進(jìn)行定性檢。農(nóng)藥殘留快速檢測法是一類快速檢測農(nóng)藥殘留的方法，主要用來阻止有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜和水果流入市場。20世紀(jì)60年代氣相色譜法（GC）應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析,大大提高了農(nóng)藥殘留的檢測水平，20世紀(jì)80年代以來，高效液相色譜法開始廣泛應(yīng)用于對熱不穩(wěn)定和離子型農(nóng)藥及其代謝物的分析，色譜法雖然定量準(zhǔn)確、靈敏度高，但所需設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員操作，且分析時(shí)間長不利于現(xiàn)場監(jiān)測。我國農(nóng)藥殘留分析檢測始于上世紀(jì)50年代，其分析步驟一般包括樣品的采集和保存、農(nóng)藥的提取和濃縮、試樣的凈化、農(nóng)藥的定性定量分析等。這導(dǎo)致有機(jī)磷農(nóng)藥中毒成為所有中毒事件中最為常見的一種，而且危害極大。其原因在于我國是農(nóng)業(yè)大國，有89億人口在農(nóng)村，另外，我國也是農(nóng)藥大國，幾乎農(nóng)用殺蟲劑均含有機(jī)磷成分。有機(jī)磷農(nóng)藥可通過皮膚進(jìn)入人體，在噴灑過程中產(chǎn)生的氣霧可由呼吸道吸入，誤服者可由消化道吸收。有機(jī)磷農(nóng)藥主要抑制酯酶系統(tǒng)，特別是位于突觸和紅細(xì)胞膜上的乙酰膽堿酯酶以及血漿中的丁酰膽堿酯酶。根據(jù)美國《食品質(zhì)量保護(hù)法》的規(guī)定，有機(jī)磷農(nóng)藥被美國環(huán)保局列為首先接受再登記和殘留限量再評價(jià)的一類農(nóng)藥。由于有機(jī)磷農(nóng)藥對于防治農(nóng)業(yè)病蟲草害具有經(jīng)濟(jì)、高效、方便等特點(diǎn),使其在農(nóng)藥中占有重要地位，并且在今后相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)仍被廣泛使用。有機(jī)磷農(nóng)藥已有70多年的使用歷史，并仍被廣泛使用。嚴(yán)重污染食品的農(nóng)藥主要是有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類的殺蟲劑和除草劑。隨著人類物質(zhì)生活水平的提高，農(nóng)藥殘留的污染問題已引起普遍關(guān)注，各國對各種農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留都規(guī)定了越來越嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。 by the Tanninsodium citrate reduction method, labeled mAbs with this nanogold and then constructed immunochromatographic (IC) testing boards. The IC testing board was