【正文】 與社會(huì)發(fā)展司組織的有關(guān)專家的驗(yàn)收，建立了糧谷、茶葉、果蔬、果汁等農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、有機(jī)雜環(huán)類等150種以上的農(nóng)藥殘留量檢測(cè)方法31個(gè)；成功研制開發(fā)出酶抑制法、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法等農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)試紙條、速測(cè)卡、試劑盒共計(jì)24個(gè)。王剛垛等（1995）[23]，用人工抗原E600BSA免疫BALB/c小鼠，成功的建立了能分泌抗對(duì)氧磷mAb的雜交瘤細(xì)胞株。許艇等（2004）[27]成功制備氨基甲酸酯類殺蟲劑—甲萘威mAb， ng/mL， % %；與滅多威、 %。目前，在眾多標(biāo)記物中，膠體金越來(lái)越受到研究者的青睞。且不影響其生物活性。與熒光標(biāo)記物和酶標(biāo)記物相比，膠體金更加穩(wěn)定，并且不需要諸如孵育、洗板、酶反應(yīng)等一系列耗費(fèi)時(shí)間的程序。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間不到10分鐘，可檢測(cè)到的蓖麻毒素的濃度為50 ng/mL。對(duì)于小分子化合物的膠體金免疫層析技術(shù)目前已在檢測(cè)毒品方面得到廣泛的應(yīng)用，并已初步應(yīng)用在食品安全以及農(nóng)藥檢測(cè)方面。55西北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章 抗原合成與單克隆抗體的制備大多數(shù)對(duì)農(nóng)藥的免疫化學(xué)檢測(cè)法都只針對(duì)一種特定的農(nóng)藥。其后，Johnson[36]以及Alcocer[37]等人在抗體的敏感性方面做了重要改進(jìn)，但是對(duì)分析物的反應(yīng)缺乏一致性。此方法首先發(fā)展于人工抗原的制備研究。反應(yīng)式為：活潑酯法是對(duì)碳二亞胺法的改進(jìn)，由于消除了碳二亞胺對(duì)蛋白質(zhì)的直接作用，從而避免了蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)[41]。單克隆抗體與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點(diǎn)：1. 單一特異性，與一個(gè)抗原決定簇反應(yīng)；2. 可重復(fù)性，能夠提供完全一樣的抗體制劑；3. 一經(jīng)制出，可無(wú)限量地供應(yīng)；4. 生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原；5. 能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。Western免疫印跡主要試劑：（1）轉(zhuǎn)膜緩沖液： g Trisbase， g甘氨酸，200 mL甲醇，加去離子水定容至1 L，4℃貯存；（2）洗滌緩沖液：同ELISA；（3）顯色液：增敏二氨基聯(lián)苯胺（DAB）。再將產(chǎn)物（2）318 mg溶于60 mL乙醇，電磁攪拌下加入25 mL1 M KOH，室溫下繼續(xù)攪拌30分鐘；加入30 mL 1 N HCl，50 mL乙酸乙酯萃取，20mL 1 N HCl洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鎂干燥，待溶劑蒸發(fā)干凈后，殘余上柱層析（硅膠，己烷:乙酸乙酯:乙酸=200:100:8， TLC Rf ）。用1M ，室溫?cái)嚢?小時(shí)。離心后，將上清液在電磁攪拌條件下， mg BSA或37 mg OVA的4 mL （PBS，）中，常溫下繼續(xù)攪拌2小時(shí)，4℃下對(duì)2 L超純水透析兩天，凍干。將上述溶液置于U3310紫外分光光度計(jì)（HITACHI）中進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，掃描波長(zhǎng)200~300nm，光程10 mm。以后間隔兩周追加免疫一次，方法為腹腔注射100 μg HaptenBSA（溶于100 μL PBS，不加福氏佐劑），共追加免疫5次。用洗滌液緩沖液洗滌三次，拍干。37℃溫育1小時(shí)。5. 顯色：現(xiàn)配A液、B液，每孔各加50 μL，37℃溫育10min。陽(yáng)性孔中，多克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)為其效價(jià)。取抗體分泌陽(yáng)性細(xì)胞，用有限稀釋法做克隆化[42]，以獲得可穩(wěn)定分泌特異性mAb的單克隆雜交瘤細(xì)胞系?？贵w效價(jià)及參考工作濃度測(cè)定采用非競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA法。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，方法如下：1. 將非變性聚丙烯酰胺凝膠浸泡于電轉(zhuǎn)膜緩沖液中，同時(shí)將兩張同樣大小的whatman濾紙及兩塊海綿浸泡于緩沖液中。完成后的NC膜用去離子水沖洗，置于3 %脫脂奶粉中，室溫封閉1小時(shí)，用洗滌緩沖液沖膜3次，每次5分鐘。（3）單克隆抗體親和力測(cè)定非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫法測(cè)定抗體親和力。根據(jù)抗原抗體結(jié)合的S形曲線，求解不同抗原濃度下半數(shù)吸光值的抗體濃度，代入公式Ka = ( n 1) / ( nAb′ Ab) 計(jì)算親和常數(shù)，式中Ab和Ab′分別表示當(dāng)抗原濃度為Ag和Ag′時(shí)，產(chǎn)生半數(shù)吸光值的抗體濃度(mol/L)，n =Ag/Ag′。表21半抗原及中間產(chǎn)物的產(chǎn)量及產(chǎn)率Table 21 Yield of Hapten and intermediate product產(chǎn)物結(jié)構(gòu)產(chǎn)量(g)產(chǎn)率(%)4hydroxy2methylbenzoic acid79O,ODiethyl O[3methyl4(methyloxycarbonyl)phenyl]phosphorothioate72O,ODiethyl O(4carboxy3methylphenyl)phosphorothioate (Hapten A)23（1）完全抗原的制備以混合酸酐法制備人工免疫原（HaptenBSA） mg，產(chǎn)率為65 %，人工檢測(cè)抗原（HaptenOVA）， %；以活潑酯法制備人工免疫原(HaptenBSA) ，產(chǎn)率為57 %，人工檢測(cè)抗原（HaptenOVA） mg， %。因此，在268nm吸收峰處測(cè)定HaptenBSA吸光度值，較少受到BSA的影響，可用來(lái)計(jì)算其中Hapten的含量。圖23 Hapten的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Standard curve of Hapten在268nm波長(zhǎng)處測(cè)定人工免疫原和人工檢測(cè)抗原的吸光度值（各200 μg/mL），并由圖23中標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各自所含的Hapten的量，從而計(jì)算出Hapten對(duì)載體蛋白的分子偶聯(lián)比，結(jié)果見表22，可以看出，活潑酯法的偶聯(lián)比（Hapten:載體蛋白）高于混合酸酐法；并且無(wú)論哪種方法，以BSA為載體蛋白的半抗原偶聯(lián)率均高于以O(shè)VA的偶聯(lián)抗原。結(jié)果顯示，用混合酸酐法制備的免疫原免疫效果較好，兩次免疫后小鼠血清抗體效價(jià)即可達(dá)到1:60,000~120,000，且第二次加強(qiáng)后抗體滴度增長(zhǎng)較為平穩(wěn)。末次免疫后三天取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp 2/0細(xì)胞融合，融合劑為PEG－1500，操作參照文獻(xiàn)介紹的方法進(jìn)行。圖25 mAb的SDSPAGE電泳結(jié)果Figure 25 SDSPAGE electrophoresis of mAb（2）單克隆抗體的鑒定1）Ig亞類測(cè)定：經(jīng)Ig亞類試紙鑒定，所制備的mAb為IgG1，κ輕鏈。圖26使用抗HaptenBSA的單克隆抗體對(duì)HaptenBSA以及BSA進(jìn)行Western blotting分析Figure 26 Western immunoblotting of analysis of HaptenBSA and BSA using the monoclonal antibodyA:非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，B:Western blotting；抗原1:活潑酯法制備的HaptenBSA，抗原2: 混合酸酐法制備的HaptenBSA.（4）mAb親和力測(cè)定：以非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA對(duì)初步純化后的單克隆抗體做親和力常數(shù)的測(cè)定。由于大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥具有一個(gè)芳香環(huán)和一個(gè)硫磷酰基部分，因而，合成的半抗原也應(yīng)具有這兩個(gè)組成部分才能使所產(chǎn)生的抗體對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥，而非僅對(duì)某一種有機(jī)磷農(nóng)藥具有較高的親和力。（2）合適的免疫原是制備高質(zhì)量抗體的前提。因此，本研究選用BSA作為載體蛋白制備免疫原，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)此免疫原具有較好的免疫原性。這兩種方法避免了交聯(lián)劑對(duì)蛋白的直接作用，從而避免了蛋白分子間的交聯(lián)。用包被原HaptenOVA包被酶標(biāo)板，未偶聯(lián)的OVA為對(duì)照抗原包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA檢測(cè)抗血清，結(jié)果表明抗血清中含有抗Hapten的抗體，且本試驗(yàn)所用包被原HaptenOVA與免疫原HaptenBSA具有不同載體，這就消除了抗血清中抗BSA抗體對(duì)試驗(yàn)可能造成的假陽(yáng)性結(jié)果，從而更真實(shí)地反應(yīng)出抗血清中存在抗Hapten抗體。對(duì)于免疫原來(lái)說(shuō)，分子偶聯(lián)比可以影響免疫效果：過(guò)低的分子偶聯(lián)比，即載體蛋白表面所帶半抗原表位過(guò)少，則不足以刺激機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體；而載體蛋白上帶有太多的Hapten會(huì)阻礙蛋白與抗原呈遞細(xì)胞受體的相互識(shí)別，以及與提呈抗原相關(guān)的蛋白水解酶與免疫原空間上的靠近[57]。這樣的結(jié)果與以上討論相符。在非變性凝膠電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)的遷移率取決于蛋白所帶電荷、分子量及分子形狀。根據(jù)其特點(diǎn)和步驟可分為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）和酶放大免疫測(cè)試法（EMIT）[58]。加入酶底物顯色后,進(jìn)行比色，可以測(cè)定待測(cè)農(nóng)藥含量。間接夾心法是將樣品中的抗原結(jié)合于過(guò)量的固相抗體，加入過(guò)量的同種抗體（一抗），洗滌后加入酶標(biāo)二抗，最后加入底物反應(yīng)，據(jù)顯色程度確定待測(cè)抗原的含量。根據(jù)方陣滴定結(jié)果分別對(duì)抗原抗體最佳工作濃度確定后，將四種有機(jī)磷農(nóng)藥的甲醇溶液100 mg/mL，以樣品緩沖液分別稀釋為10000，1000，100，10，1，0 μg/mL，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA法檢測(cè)測(cè)定。將測(cè)定值換算為B/Bo100%，并以其為縱坐標(biāo)，樣品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，使用SPSS 。空白以上述方法制備，但不添加農(nóng)藥。利用logistic擬合曲線模型對(duì)圖31中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，毒死蜱的logistic曲線為：Y=(1++)；甲基對(duì)硫磷的logistic曲線為：Y=(1++)；辛硫磷的logistic曲線為：Y=(1++)；三唑磷的logistic曲線為：Y=(1++),擬合系數(shù)R2，由此得到四種農(nóng)藥的50 %抑制濃度（IC50）及最低檢測(cè)限（LOD），見表32。1177。玉米10177。土壤10177。a：表中結(jié)果均為三次檢測(cè)的平均值，b：自來(lái)水樣品中添加毒死蜱的濃度單位為ng/mL（1）由于有機(jī)磷農(nóng)藥為小分子半抗原，缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與半抗原結(jié)構(gòu)相似度高的有機(jī)磷農(nóng)藥，如毒死蜱和甲基對(duì)硫磷，對(duì)其檢測(cè)靈敏度較高，線性檢測(cè)范圍也較寬范。除此之外，水和土壤提取物中的腐植酸能夠與單克隆抗體非特異性的結(jié)合，從而干擾抗體與待檢測(cè)物的特異性結(jié)合[62]。對(duì)于以上討論的基質(zhì)效應(yīng)，可以通過(guò)改變緩沖液組分或向體系中加入BSA等方法加以改善[60,62,69]。西北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第四章 有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測(cè)研究－（2）膠體金標(biāo)記側(cè)向流免疫檢測(cè)技術(shù)免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體（如抗體或抗原。（3）我國(guó)對(duì)不同農(nóng)產(chǎn)品中毒死蜱的最低限量標(biāo)準(zhǔn)1 mg/kg；不低于美國(guó)、日本、歐盟等出口地的限量標(biāo)準(zhǔn)[70,71]。有研究表明，水溶性溶劑可以最大限度減少基質(zhì)效應(yīng)，然而大多數(shù)殺蟲劑微溶于水或難溶于水，因而必須使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取[72]。（2）在ELISA檢測(cè)法的實(shí)際應(yīng)用中，樣品除含有檢測(cè)目的物以外，還可能含有其他影響檢測(cè)的化合物。而對(duì)四種有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)敏感度的差別，我們分析推測(cè)是與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，對(duì)比半抗原結(jié)構(gòu)及表1中農(nóng)藥結(jié)構(gòu)，可以看出，半抗原由芳香環(huán)和硫磷?；鶅刹糠纸M成，毒死蜱結(jié)構(gòu)與所設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)較為接近，甲基對(duì)硫磷為甲氧基衍生物，而辛硫磷和三唑磷的化學(xué)結(jié)構(gòu)在這兩部分之間分別插入了一個(gè)氰基亞芐氨基基團(tuán)和一個(gè)三唑基團(tuán)。自來(lái)水b10177。蔥10未撿出.1177。1177。對(duì)添加量為10 mg/kg的被檢樣品，回收率的平均值在88~94 %之間；對(duì)于添加量為1 mg/kg的被檢樣品，回收率平均值在60~82 %之間，未添加毒死蜱的樣品均不出現(xiàn)假陽(yáng)性。、檢測(cè)抗原最佳工作濃度經(jīng)方陣實(shí)驗(yàn)，間接ELISA中以HaptenBSA為包被原，最佳工作濃度為10 μg/mL，104(表31)。對(duì)蘋果、獼猴桃、紅豆、玉米、蔥、蒜、土壤等樣品采用同樣的萃取方法：瓜果以純水清洗并切碎，以1g/份樣品添加毒死蜱，以5 mL甲醇萃取1小時(shí)，土壤以同樣的方法加樣、萃取。再加入以稀釋液稀釋的抗體，50 μL/孔。 材料主要試劑與儀器乙基毒死蜱西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境與勞動(dòng)衛(wèi)生教研室惠贈(zèng)純度均為95％以上辛硫磷西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境與勞動(dòng)衛(wèi)生教研室惠贈(zèng)純度均為95％以上三唑磷西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境與勞動(dòng)衛(wèi)生教研室惠贈(zèng)純度均為95％以上甲基對(duì)硫磷西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究中心惠贈(zèng)純度均為95％以上甲醇西安化學(xué)試劑廠分析純3,3’,5,5’四甲基聯(lián)苯胺（TMB)上海Roche生物技術(shù)有限公司 、抗原最佳工作濃度選擇用方陣法對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)法中抗原抗體最適工作濃度進(jìn)行選擇， mol/L pH ,包被固相載體，每一種包被濃度均與不同濃度的抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，酶標(biāo)二抗均為1:5000稀釋。此方法的優(yōu)點(diǎn)是一個(gè)農(nóng)藥抗體可以結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)二抗，大大提高了方法的靈敏度。直接競(jìng)爭(zhēng)法是將抗體包被到聚苯乙烯微孔反應(yīng)板上，加入酶標(biāo)記農(nóng)藥和待測(cè)農(nóng)藥,酶標(biāo)記農(nóng)藥和待測(cè)農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體的結(jié)合。Western blotting結(jié)果顯示，我們制備的單克隆抗體只針對(duì)免疫原上的Hapten抗原表位，親和力高且不存在與BSA的交叉反應(yīng)，可以利用此單克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)以及側(cè)向?qū)恿髟嚰垪l等進(jìn)一步研究。但偶聯(lián)反應(yīng)受諸多因素影響，如反應(yīng)所采用的緩沖液的 pH值、溶液中蛋白質(zhì)的濃度、半抗原與蛋白質(zhì)的比例等因素的調(diào)整都很重要。有許多文獻(xiàn)都沒有報(bào)道偶聯(lián)物的結(jié)合比，主要原因可能是一般測(cè)定方法難以準(zhǔn)確定量計(jì)算，只能通過(guò)免疫動(dòng)物后是否產(chǎn)生特異性的抗血清來(lái)最終確定免疫抗原的合成是否成功。Wu .[54]認(rèn)為分子偶聯(lián)比為1:3 ~1:45時(shí)，免疫效果最佳；而Schneid[55]的研究表明最佳偶聯(lián)比在1:10 ~1:20。后一種方法更能說(shuō)明問(wèn)題。（3）混合酸酐法是利用半抗原分子中的羧基在三級(jí)胺的存在下與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，生成活潑的混合酸酐，然后與蛋白載體上的伯