【正文】 分別準(zhǔn)確稱取大青葉各5 g，分別加入40%乙醇100 mL，在60℃情況下超聲波處理60、80、100、120min然后進(jìn)行抽濾，殘?jiān)孟嗤瑵舛群腕w積的乙醇再超聲提取一次,合并兩次提取液,回收乙醇,濃縮液冷凍干燥,得到黃酮提取物，定容至100 mL，按測定其吸光度，從工作曲線方程查出黃酮含量，再計(jì)算出黃酮提取率。自由基的清除率、ABTS乙醇濃度為60%總黃酮的提取率最高，當(dāng)提取液濃度進(jìn)一步增加時，總黃酮的提取率急劇下降，其原因可能是隨著提取溶劑乙醇極性的減小，葉綠素溶出量增加，而含有多個糖分子的黃酮苷(極性較大)溶出量減少所致。重復(fù)試驗(yàn)三次，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差。（1）乙醇濃度的確定分別準(zhǔn)確稱取5 g的大青葉，各加入100 mL乙醇，乙醇濃度分別為0%，20%，40%，60%，80%，100%在60℃條件下超聲波處理1h。V—測定時取樣體積，mL。）n—稀釋倍數(shù)，量綱為1。樣品總黃酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)式中：X—測出的濃度，mg/ mL。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可得濃度數(shù)據(jù)（以蘆丁為參比）,三次結(jié)果取平均值。取稀釋好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作為參比溶液。表21： 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)序號濃度（ug/ml）吸光度100215330445560675圖22：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線5%亞硝酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取5g亞硝酸鈉用水溶解后定容至100ml容量瓶中 10%硝酸鋁溶液：準(zhǔn)確稱取10g硝酸鋁定用水溶解后定容至100ml容量瓶中 1mol/L氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取10g氫氧化鈉用水溶解后定容至250ml容量瓶中根據(jù)查閱文獻(xiàn)總黃酮在波長為510nm處吸收值最大。（以試劑空白做參比）以吸光度A 為縱坐標(biāo),濃度c為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于黃酮類成分均有2苯基色原酮為母核的結(jié)構(gòu)，作為黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品要具有其母核，通過查閱文獻(xiàn)確定蘆丁也有此結(jié)構(gòu)，因此以蘆丁為基準(zhǔn)物測定天然植物中總黃酮的含量，蘆丁的結(jié)構(gòu)式為圖21： 圖21：蘆丁結(jié)構(gòu)式 精密稱取120 ℃,用60%乙醇溶解后定容至100mL 容量瓶中,搖勻。大青葉子 采摘于海口市火山口公園樣品60℃烘干粉碎機(jī)粉碎，過20目篩，裝入試劑瓶中備用。azinodi (3ethylbenzthiazoline6sulfpnic acid)，即2, 239。（2,2diphenyl1picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）ABTSRotavapor R200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 。型數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DB。 實(shí)驗(yàn)儀器電子天平AR2140。此外，大量研究表明黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、抗衰老、提高機(jī)體免疫力、瀉下、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙及抗變態(tài)等藥理活性。黃酮類化合物具明顯的擴(kuò)冠作用，對缺血性腦損傷和心肌缺血性損傷也有很好的保護(hù)作用，黃酮還可以用于抗心律失常。由于黃酮類化合物分布廣泛，所以它們具有多種藥理活性。本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑，進(jìn)行了超聲波提取大青葉中總黃酮的研究，結(jié)果表明，乙醇濃度為40%，超聲時間為80 min，超聲溫度為60℃，料液比為1:30，為最佳提取條件。因此，超聲波不僅大大縮短了提取時間，而且提高了有效成分的提出率以及原料的利用率。⑹超聲波提取法 用超聲法提取黃酮類物質(zhì)，是近幾年來新發(fā)展的方法，具有效率高、時間短、操作簡便、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。同時還可以通過控制臨界溫度和壓力的變化，來達(dá)到選擇性提取和分離純化的目的。而隨著超臨界流體萃取(SFE)技術(shù)的迅速發(fā)展，在天然藥用植物有效成分提取中應(yīng)用越來越廣泛。CO2SFE的最大特點(diǎn)是無溶劑殘留、常溫條件進(jìn)行、產(chǎn)品純度高、收率高等特點(diǎn)。⑸臨界流體萃取法 超臨界流體萃取法是近十年來才發(fā)展起來的一種新型技術(shù)，其作用原理是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的，再通過控制臨界溫度和壓力，達(dá)到其選擇性提取和分離純化的目的。通過酶反應(yīng)可在較較溫和的條件下將植物組織分解，加速有效成分的釋放，還可將影響藥物制劑的雜質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等分解去除，具有專屬作用強(qiáng)、無有機(jī)溶劑消耗和環(huán)境污染、效率高等特點(diǎn)。原理是復(fù)合酶充分破壞了以纖維素為主的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞間相連的果膠物質(zhì)，將原料中的果膠完全分解成小分子物質(zhì)，使提取傳質(zhì)阻力減小，果肉中的黃酮類物質(zhì)可以充分地釋放出來。中藥提取物中的雜質(zhì)大多數(shù)為淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等，可選用相應(yīng)的酶予以分解除去。對于一些黃酮類物質(zhì)被細(xì)胞壁包圍不易提取的原料可以采用酶法提取。(4)溶劑用量少(可較常規(guī)方法少50%~90%)，耗能低，無環(huán)境污染，節(jié)約成本。②效率高，微波加熱是內(nèi)加熱，直接加熱樣品，體系升溫快速均勻、無熱梯度、無滯后效應(yīng)等特點(diǎn)，萃取時間短，萃取效率高。相反，如果萃取劑為強(qiáng)極性物質(zhì)時，由于萃取劑強(qiáng)烈吸收微波，只有部分微波能到達(dá)物料，此時不利于微波破壁作用的發(fā)揮，非熱效應(yīng)可能占主導(dǎo)地位。微波輔助萃取過程中，微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)共同發(fā)揮作用。一是微波輻射能穿透提取介質(zhì)，到達(dá)物料內(nèi)部，使基質(zhì)內(nèi)部溫度迅速上升，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分自由流出。微波輔助萃取(microwave assistant extraction，MAE)是利用微波能作為一種輔助手段，選擇性地使樣品中預(yù)分析組分從樣品基體中滲出，達(dá)到實(shí)現(xiàn)與基體的分離。在微波提取過程中，微波加熱與常規(guī)加熱提取的導(dǎo)熱方式不同。當(dāng)微波在傳輸過程中遇到不同的介質(zhì)時，微波將依據(jù)介質(zhì)性質(zhì)的不同，產(chǎn)生反射、吸收以及穿透等現(xiàn)象，不同的介質(zhì)物料在受到微波作用時對微波的敏感性不同。酸化時需調(diào)節(jié)pH=2~3 即可，如酸度過高，酸會與黃酮類化合物生成烊鹽而溶解。例如從菊花中提取黃酮物質(zhì)時，用pH=10的氫氧化鈉溶液浸出的效果較好；而從槐米中提取蘆丁，則應(yīng)用堿性較強(qiáng)的飽和石灰水作溶劑，這樣則有利于蘆丁成鹽溶解。石灰水可以使一些水溶性雜質(zhì)沉淀生成鈣鹽沉淀，有利于浸液純化，但是浸出效果不如氫氧化鈉水溶液效果好，同時有些黃酮類化合物能與鈣結(jié)合成不溶性物質(zhì)，不被溶出。常用的堿性溶液是稀氫氧化鈉和石灰水（氫氧化鈣水溶液）。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，高濃度的醇(90%~95%)適用于提取黃酮苷元，中等濃度的醇(60%左右)適用于提取黃酮苷，提取次數(shù)一般是2~4次。近年來對于黃酮類化合物的現(xiàn)代提取方法進(jìn)行了較多的研究，但與實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用尚有一段距離，現(xiàn)對其中幾種提取方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡單介紹。傳統(tǒng)的方法有溶劑法、浸漬法、滲流法和回流法等。目前，對苷類和極性較大的苷元，常用某些極性較大的混合溶劑，如甲醇水(1:1)、水、甲醇、乙醇、丙酮等進(jìn)行提取，而對大多數(shù)苷元如異黃酮、黃烷酮、雙氫黃酮醇等采用苯、乙醚、氯仿或乙酸乙酯等極性小的溶劑進(jìn)行提取。另外，糖的結(jié)合位置不同，對苷在水中的溶解度也有一定的影響。黃酮類化合物中引入的羥基越多，在水中溶解度也越大；羥基經(jīng)甲基化或乙?；螅黾恿嗽谟袡C(jī)溶劑中的溶解度。 黃酮類化合物種類多，其結(jié)構(gòu)和狀態(tài)的不同使得溶解度存在著很大的差異，游離的苷元難溶或不溶于水，而易溶于甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚等有機(jī)溶劑或稀堿溶液，其中有些平面型分子，如黃酮，黃酮醇，查耳酮等，分子間排列緊密，引力較大，難溶于水；而非平面型分子，如二氫衍生物，其分子排列較松弛，引力降低，有利于水分子的進(jìn)入，較易溶于水。隨著對黃酮類化合物研究和應(yīng)用的不斷發(fā)展，不少新黃酮類化合物相繼被發(fā)現(xiàn)，且以黃酮類化合物為先導(dǎo)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和結(jié)構(gòu)優(yōu)化的新代藥物具有更強(qiáng)的針對性和效應(yīng)性。此外，有些黃酮類化合物還可作為天然甜味劑、天然色素等使用，也可開發(fā)成具有特異性功能、靶標(biāo)專一性強(qiáng)、安全性較強(qiáng)的無公害農(nóng)藥。體內(nèi)研究亦發(fā)現(xiàn)5羥黃酮顯著降低永久性大腦中動脈阻塞的動物模型缺血性損傷口 。此外，銀杏黃酮對小鼠體外培養(yǎng)腦組織中的MDA產(chǎn)生一定的抑制作用，并且表現(xiàn)出降低NO的作用，且有較明顯的劑量依賴[40]；臨床中常用銀杏達(dá)莫(其主要成分為銀杏總黃酮)注射液治療腦栓塞等疾病，說明黃酮類化合物對腦血管疾病有不錯的療效?？鄥⒖傸S酮能明顯對抗烏頭堿、哇巴因及氯仿誘發(fā)的心率失常，其作用機(jī)制可能是阻斷β受體、阻滯心肌細(xì)胞鈉鉀通道[39] 。在對黃酮類化合物對抗心律失常的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，槲寄生黃酮(VCF)可對抗烏頭堿所引起的心律失常，并認(rèn)為其主要原理為阻斷LcaL有關(guān)[37] 。慢性高血壓可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，宋瑞霞等[35]報(bào)道甘肅黃芪黃酮類化合物可以抑制AngⅡ所致的臍靜脈血管內(nèi)皮損傷，具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。高血壓為當(dāng)今社會的多發(fā)病和高發(fā)病。有報(bào)道[32]醋柳黃酮(雅達(dá)心達(dá)康)對冠心病心絞痛伴心肌缺血患者可以在不同程度改善胸悶、心悸等臨床癥狀，改善心肌缺血情況，減少發(fā)作次數(shù)、減輕發(fā)作程度，提高患者生活質(zhì)量。陳冬梅[31]在研究中發(fā)現(xiàn)苦碟子總黃酮注射液(TFS)對急性心肌梗死具有不錯的療效，能明顯降低急性心肌梗死大鼠心肌梗死區(qū)及非梗死區(qū)FFA水平，有利于改善心肌代謝，恢復(fù)心肌的能源供應(yīng)；能明顯降低急性心肌梗死大鼠血漿ET、AngⅡ及TXA2水平，增加血漿PGI2水平及PGI2／TXA2比值，保持PGI2／TXA2生理平衡，有利于擴(kuò)張血管，增加心肌供血；能在急性心肌梗死早期抑制原癌基因表達(dá)，并提高Bcl2／Bax基因表達(dá)比例，抑制p53及Fas的表達(dá)，表明其具有對抗心肌細(xì)胞凋亡作用。劉水濤等[30]。心肌供氧不足可由器質(zhì)性冠狀動脈粥樣硬化狹窄或(和)動力性冠狀動脈痙攣狹窄引起，出現(xiàn)胸悶、胸痛、心肌酶譜升高、心電圖異常等臨床表現(xiàn)。高脂血癥是動脈粥樣硬化的主要發(fā)病因素之一，在研究中有報(bào)道黃酮類化合物可降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)水平，并可同時提高HDL水平，降低動脈粥樣硬化及冠心病的發(fā)病率[28]。但對于是否在此類病人中運(yùn)用黃酮類化合物進(jìn)行替代治療還在爭議之中口[27] 。在實(shí)施卵巢切除手術(shù)后，由于缺乏雌激素導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，如果補(bǔ)充染料木素或17β雌二醇，癥狀就會改善。據(jù)報(bào)道，料木素(genistin)、金雀花異素(5,7二羥基439。此外，還可對糖尿病并發(fā)癥有一定治療作用。⑸內(nèi)分泌系統(tǒng)作用活性黃酮類化合物還有降血糖作用，主要表現(xiàn)在β細(xì)胞保護(hù)作用及降血糖作用。ml1)能顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖，Z1和Z2(~50／ug趙鵬等[21]采用乙醇建立大鼠肝損傷模型，將大鼠根據(jù)體重分層隨機(jī)分為陽性組、對照組及葛根黃酮低、中、高劑量組，經(jīng)試驗(yàn)測定發(fā)現(xiàn)葛根黃酮對乙醇引起的肝損傷具有保護(hù)作用，且與劑量呈一定比例關(guān)系。黃酮類化合物對這些酶的作用，主要表現(xiàn)在信號傳導(dǎo)途徑上。⑶抗炎，免疫調(diào)節(jié)活性黃酮類化合物的抗炎，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性主要表現(xiàn)在對炎癥因子，如T細(xì)胞，B細(xì)胞，巨嗜細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，嗜性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和血小板的調(diào)節(jié)作用上。指腫瘤細(xì)胞暴露在某單個藥物之后，對其他結(jié)構(gòu)上無關(guān)的藥物產(chǎn)生了交叉耐藥性。并發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗癌機(jī)制之一。張強(qiáng)[17]在黃酮和黃酮醇對人食管癌細(xì)胞抑制的實(shí)驗(yàn)中選取各三種化合物作為黃酮及黃酮醇的代表，發(fā)現(xiàn)其能夠有效抑制人食管鱗癌KYSE510細(xì)胞和食管腺癌0E33細(xì)胞增殖生長。自由基的清除能力，來進(jìn)一步衡量被測物的抗氧化能力。的自由基，從而起到抗氧化的作用。若某樣品能夠清楚DPPH自由基清除能力的檢測是體外抗氧化活性測定的主要方法之一，DPPH天然抗氧劑有苯酚類、黃酮類、生物堿類、靴質(zhì)類、皂昔類等。為了加強(qiáng)防御系統(tǒng)，減少氧化傷害，就必須從體外補(bǔ)充一些抗氧化物質(zhì)，如食品類抗氧化成分有維生素C、維生素E，類胡蘿卜素，芝麻酚等。如從水飛薊果實(shí)中提取的水飛薊素，3氧化黃酮水飛薊，異水飛薊素，水飛薊亭等均具有明顯的抗氧化作用，其中以水飛薊素抗氧化活性最強(qiáng)。傳統(tǒng)合成抗氧化劑存在一定的毒性，甚至可導(dǎo)致異性，癌癥，許多國家開始限制甚至禁止使用某些合成抗氧化劑。黃酮類化合物具有廣譜的藥理活性和較低的毒性，現(xiàn)就黃酮類化合物的主要藥理作用介紹如下。黃酮類化合物不僅結(jié)構(gòu)多樣，而且不同類型的化合物表現(xiàn)出了不同的生物活性和功能。黃酮化合物廣泛存在于蔬菜，水果，牧草和藥用植物中，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物。⑷顯色反應(yīng)黃酮化合物分子中存在酚羥基和苯并吡喃酮環(huán)，其顯色反應(yīng)主要是利用了這些基團(tuán)的性質(zhì)。黃酮類化合物溶于濃硫酸中生成的鹽，常常表現(xiàn)出特殊的顏色，可用于鑒別。由于酚經(jīng)基數(shù)目及位置不同，酸性強(qiáng)弱也不同，以黃酮為例，其酚輕基酸性強(qiáng)弱順序依次為:7,4,OH7或4,OH一般酚OH5,OH此性質(zhì)可用于提取，分離及鑒定工作。相結(jié)合的糖鏈越長，在水中的溶解度就越大。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑中。而二氫黃酮及二氫黃酮醇等，因系非平面型分子，故排列不緊密，分子間引力降低，有利于水分子進(jìn)入，水中溶解度稍大。一般游離苷元難溶于或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酷、乙醚等有機(jī)溶劑。查耳酮和橙酮顯深黃綠色，亮黃綠熒光，而二氫黃酮（醇）和兒茶素不顯色?；ㄉ占败赵念伾cpH有關(guān)：pH7時顯紅色，pH=，pH。黃酮類化合物的顏色與分子中是否存在苯甲酰與桂皮酰交叉共軛體系，及助色基團(tuán)（OH,OCH3）的種類，數(shù)目有關(guān)。從結(jié)構(gòu)上可見，游離苷元中二氫黃酮，二氫黃酮醇，黃烷及黃烷醇有旋光性。 目前黃酮類化合物是泛指兩個苯環(huán)(A 與 B)通過三個碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。由于其分布廣且部分化合物在植物中的含量較高，而且多數(shù)化合物易以結(jié)晶形式獲得，所以它們是較早被人類發(fā)現(xiàn)的一類天然產(chǎn)物。如上法，一日三次，早中晚各一次[13]。⑨治療蛇咬傷 用鮮大青葉打爛絞汁內(nèi)服治療火毒型毒蛇咬傷，對消腫止痛有顯著療效，通常用藥兩三天即能消腫止痛，一般約七天治愈。成品呈棕褐色，有油香涂患處，每天換藥1次。加藥粉（用乳香、沒藥、白礬、鉛丹、銅綠、膽礬各50g；過6號篩），成稠膏。水煎服，每日1劑[1]