大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題及對(duì)策-文庫(kù)吧資料
2025-06-13 17:37本頁(yè)面
【正文】 細(xì)胞的需要。在相當(dāng)大的一個(gè)范圍內(nèi), 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比。3. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法在細(xì)胞中, 葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。他采用這一方法, 使氨的濃度降低了一半。氨對(duì)細(xì)胞的毒性比乳酸大得多, 表現(xiàn)為降低比生長(zhǎng)速率, 增加死亡速率。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 應(yīng)用這一方法的報(bào)道也較多。由于葡萄糖的價(jià)格相對(duì)低廉, 這種方法很有前途。灌注葡萄糖的同時(shí), 要間歇或連續(xù)地加入其他組分, 以避免營(yíng)養(yǎng)缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在較低水平, 因?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)不依賴糖酵解 , 即使沒(méi)有葡萄糖, 細(xì)胞仍可以通過(guò)降解谷氨酰胺獲得能量。 在產(chǎn)物合成期降低葡萄糖的濃度, 降低乳酸的產(chǎn)生速率, 避免乳酸的積累, 減少毒害, 降低死亡速率, 維護(hù)持活細(xì)胞數(shù)在較高水平。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖 , 還可限制葡萄糖減少乳酸的生成, 使初始葡萄糖濃度較低, 在培養(yǎng)過(guò)程中再添加。具體有以下方法。所以, 在培養(yǎng)中調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞的代謝途徑一直較受重視。但是, 一方面由于灌注培養(yǎng)細(xì)胞濃度很高, 提高灌注速率, 營(yíng)養(yǎng)成分的供給十分充分, 氨和乳酸的產(chǎn)生速率也增加了。在分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的這一問(wèn)題尤為突出。在細(xì)胞生長(zhǎng)期有的細(xì)胞可能會(huì)因比生長(zhǎng)速率過(guò)大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞, 這時(shí)就應(yīng)控制比生長(zhǎng)速率在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶７侄闻囵B(yǎng)應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)條件進(jìn)行。然而, 在細(xì)胞培養(yǎng)中, 細(xì)胞生理狀態(tài)的檢測(cè)很麻煩。細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同時(shí)期, 不僅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。溶氧過(guò)低, 細(xì)胞過(guò)氧的需求得不到滿足, 依然會(huì)降低產(chǎn)物蛋白的產(chǎn)率。溶氧過(guò)高, 細(xì)胞就會(huì)加速消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物。通常在細(xì)胞生長(zhǎng)初期控制溶氧的較低的水平, 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到較高的濃度時(shí), 提高溶氧水平。2. 1. 3 溶氧階段培養(yǎng) 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溶氧值為60% , 但有人發(fā)現(xiàn)雜交瘤的最適溶氧為100%。有人把CO 2 的濃度由5% 降為2. 5% ,胞內(nèi)pH 提高了0. 2 個(gè)單位。 而胞內(nèi)pH 升高0. 2 個(gè)單位,可以提高糖酵解速度50%。近年來(lái), 對(duì)胞內(nèi)pH 的研究比較活躍。2. 1. 2 pH 值階段培養(yǎng)對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞, 培養(yǎng)液中合適的pH為7. 2—7. 4。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對(duì)細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見(jiàn)優(yōu)勢(shì)。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過(guò)程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長(zhǎng)速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞。2. 1 階段培養(yǎng)一般認(rèn)為, 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來(lái)源動(dòng)物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對(duì)細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見(jiàn)優(yōu)勢(shì)。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過(guò)程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長(zhǎng)速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞。2. 1 階段培養(yǎng)一般認(rèn)為, 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來(lái)源動(dòng)物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。 灌注培養(yǎng)可以從兩個(gè)方面入手, 一是改變動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境, 實(shí)行階段培養(yǎng)。2 灌注培養(yǎng)方法在灌注培養(yǎng)前, 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理特性進(jìn)行充分的考察, 是十分必要的, 能為灌注培養(yǎng)提供有益的參考。懸浮灌注培養(yǎng)是在普通懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上, 加上一個(gè)細(xì)胞分離器而成, 以微載體懸浮培養(yǎng)加旋轉(zhuǎn)過(guò)濾分離器最為常見(jiàn)。同其他方法相比,灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí), 并可大大降低勞動(dòng)力消耗。在灌注培養(yǎng)中, 細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中, 收獲培養(yǎng)液的同時(shí)不斷地加入新鮮的培養(yǎng)基。直到六十年代, 灌注培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn), 為動(dòng)物細(xì)胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)開(kāi)辟了廣闊的前景。如何完善細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù), 提高動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)率, 一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。不斷成熟的大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅在生產(chǎn)藥用蛋白方面，而且在基因治療、基因疫苗 用的病毒載體的生產(chǎn)、人工器官和組織移植用分化細(xì)胞的培養(yǎng)等研究領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。改善細(xì)胞環(huán)境是當(dāng)前眾多 生物反應(yīng)器及控制器研究者的不懈努力方向。細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需要的重點(diǎn) 將繼續(xù)朝著維持或增加產(chǎn)品質(zhì)量及一致性上努力。5 結(jié)論與展望可以推斷，更多的代謝中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)微影響和機(jī)理將逐漸得以充分認(rèn)識(shí)。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法已經(jīng)完成。細(xì)胞呼吸商似乎是衡量細(xì)胞生理狀態(tài)的潛在的有用參數(shù)，可測(cè)定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計(jì)算 呼吸商。最近幾年中有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程監(jiān)控的研究迅速增多。在生物反應(yīng)器中，溫度、pH值、溶解氧濃度是細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大的早期研究?jī)?nèi)容。離線取樣測(cè)定特別是產(chǎn)物濃度測(cè)定往往需要一天的時(shí)間，因此這種 測(cè)定結(jié)果，不能用來(lái)及時(shí)指導(dǎo)生物反應(yīng)器有關(guān)參數(shù)的控制和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費(fèi)用。構(gòu)建細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞周 期特異表達(dá)調(diào)控具有重要研究和應(yīng)用意義。但是，SV40早期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子調(diào) 控基因表達(dá)均發(fā)生在S期，CHO細(xì)胞中腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AMLP)調(diào)控外源基因表達(dá)是在G1期。另外，控制外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子的特性是基因表達(dá)的基礎(chǔ)之一。在CHO細(xì)胞中通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并過(guò)量表達(dá)BiP，阻止了未糖基化tPA突變體的分泌。tPA表達(dá)水平及分泌效率均和它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的結(jié)合蛋白(BiP)這種分子伴侶的結(jié)合程度負(fù)相關(guān)。通過(guò)細(xì)胞工程方法使細(xì)胞高水平表達(dá)外源基因并正確加工表達(dá)產(chǎn)物，從而提高整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率，也成為應(yīng)用大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)外源目的蛋白的研究的重 要手段。有些細(xì)胞株依賴于血清源性生長(zhǎng)因子的特性可通過(guò)分子遺傳途徑予以改變，即導(dǎo)入特異生長(zhǎng)因子的基因，使細(xì)胞能合成自身的生長(zhǎng)因子來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需要，而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)副作用。在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，細(xì)胞對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性往往是克隆特異性 的，每個(gè)新的克隆常需要重新配制培養(yǎng)基和適應(yīng)過(guò)程。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生 物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。在經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清培養(yǎng)基成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的一大課題。其優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品成本降低，產(chǎn)量提高，遺傳一致性高。因此一種“細(xì)胞靜止”過(guò)程可以有效降低營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒 物產(chǎn)生，提高CHO細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)率。因此，需要尋求
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