艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測方法-文庫吧資料
2025-06-01 18:19本頁面
【正文】 （序列測定法） 檢 測 流 程 病人血漿標本 HIV RNA 病毒 cDNA HIV RT和 PR基因片段 序列測定 結(jié)果解釋 RNA提取 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴增 特定的解釋系統(tǒng) 標本 新鮮 EDTA抗凝血漿，或 80℃ 保存，避免反復凍融 病毒 RNA提取（ Qiagen公司試劑盒 ） 裂解標本，滅活 RNA酶 加到離心柱中， RNA與硅膠膜結(jié)合 洗兩次，去除雜質(zhì) 用無 RNA酶的緩沖液洗脫 RNA 收集 RNA備用 優(yōu)點：操作簡便、快速、得率高 逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 反應體系： 10XBuffer 1?l dNTP ?l 外側(cè)反向引物 1?l RNase inhibitor ?l MMuLV RT ?l DEPC水 2?l RNA模板 5?l 42℃ 水浴 1小時， 95℃ 5 分鐘滅活 RT 巢式 PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第一輪擴增反應體系 ： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 外側(cè)正向引物 1?l 外側(cè)反向引物 1?l Taq酶 ?l 水 ?l cDNA模板 10?l 94℃ 5min， 94℃ 30sec， 55℃ 30sec， 72℃ 30循環(huán) 巢式 PCR擴增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第二輪擴增反應體系 ： 10XBuffer 5?l MgCl2 3?l dNTP 1?l 內(nèi)側(cè)正向引物 1?l 內(nèi)側(cè)反向引物 1?l Taq酶 ?l 水 ?l 第一輪擴增產(chǎn)物 10?l 94℃ 5min， 94℃ 30sec， 55℃ 30sec， 72℃ 30循環(huán) 擴增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳 擴增產(chǎn)物純化 QIAquick Gel extraction試劑盒 核酸序列測定 雙脫氧鏈末端終止法 : Protease: CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTT RT: AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAA
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