【正文】 菌落的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來(lái)觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來(lái)保藏菌種。 ３）半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。 ? 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)區(qū)分： １）液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒(méi)有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴，而微生物又生長(zhǎng)緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營(yíng)養(yǎng)、代謝的研究。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號(hào)等因素的影響。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。洗液有很強(qiáng)的腐蝕作用，使用時(shí)應(yīng)特別小心，避免濺到衣服、身體和其他物品上。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時(shí)間后再用清水洗凈。 用過(guò)的玻璃器皿 凡確無(wú)病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時(shí)沖洗，吸取過(guò)化學(xué)試劑的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗。 新購(gòu)的玻璃器皿 除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于１～２％的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí)，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過(guò)一定的處理，洗刷干凈。結(jié)果莢膜呈藍(lán)紫色，細(xì)胞暗藍(lán)色。 ? Tyler法：主要采用結(jié)晶紫冰醋酸染色液染色 5~7min。 ? 染色： 加番茄紅染色液于標(biāo)本上， 30s后，用細(xì)水流適當(dāng)沖洗。左手持載玻片，右手拿另一光滑的載玻片（推片），將推片一端邊緣置于菌液前方，然后稍后后拉，當(dāng)接觸菌液后，輕輕地左右移動(dòng)，使菌液沿推片接觸后緣散開(kāi)，以 30。由于莢膜的含水量在 90％以上，故染色時(shí)一般不用熱固定或微 熱固定，以免莢膜皺縮變形。莢膜的折光率低，與染料的親和力差， 不易著色。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－莢膜染色法 莢膜是細(xì)菌在新陳代謝過(guò)程中形成的分泌于細(xì)胞壁外的黏液狀物質(zhì)。然后用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán)，移至盛有 1~2ml無(wú)菌水的試管中，使菌液呈輕度渾濁。菌齡較老的細(xì)菌鞭毛易脫落，所以在染色前應(yīng)將變形桿菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上（培養(yǎng)基表面濕潤(rùn)，斜面基部含有冷凝水）連續(xù)移接幾代，以增強(qiáng)細(xì)菌的活動(dòng)力。其優(yōu)點(diǎn)是染色液可保存較長(zhǎng)時(shí)間。 ? 鏡檢 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－鞭毛染色法 注意事項(xiàng)： ? 銀染色法比較容易掌握，但染色液必須每次配制，比較麻煩。在染色過(guò)程中要仔細(xì)觀察，當(dāng)整個(gè)玻片出現(xiàn)鐵銹色沉淀和染料表面出現(xiàn)金色膜時(shí)，即用水輕輕地沖洗，一般約染 10min。 ? 染色 ：加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片區(qū)。在較高溫度下因混合液發(fā)生化學(xué)變化而使著色力日益減弱。 染色液分別貯藏于磨口玻璃瓶中，在室溫下較穩(wěn)定。 ? 鏡檢：用油鏡觀察，并記錄結(jié)果。涂片在空氣中自然干燥。配好的染色液當(dāng)日有效， 4h內(nèi)效果最好。 在 90mlB液中滴加濃氫氧化銨溶液，到出現(xiàn)沉淀后，再滴加使其變?yōu)槌吻?，然后用其?10mlB液小心滴加至澄清液中，至出現(xiàn)輕霧狀為止（此操作非常關(guān)鍵，應(yīng)格外小心）。 ? 配制染色液 ： A液： 鞣酸（丹寧酸） 5g， FeCl3 ，蒸餾水 100ml。將水瀝干后，放入95％乙醇中脫水。再放濃洗液中浸泡 5～ 6d。 銀染色法： ? 清洗玻片： 將玻片插在專用金屬架上，再放入洗衣粉過(guò)濾液（洗衣粉煮沸后用濾紙過(guò)濾，以除去粗顆粒）中，煮沸 20min。 ? 用改良法時(shí)，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次從小試管中挑取被染色的菌液時(shí)，應(yīng)先用接種環(huán)充分?jǐn)嚢瑁缓笤偬羧【?，否則菌體沉于管底，涂片時(shí)菌體太少。 巨大芽孢桿菌在 37℃ 條件下培養(yǎng) 12～ 14h效果最佳。 ? 復(fù)染：加沙黃染色液，染 2～ 3min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。 ? 固定：將玻片通過(guò)微火 3次。 ? 加熱：將此試管浸于沸水浴中，加熱 15～ 20min。 ? 結(jié)果 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－芽孢染色法 改良方法： ? 制備菌液：加 1～ 2滴自來(lái)水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取 2～ 3環(huán)的菌苔于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。 ? 水洗：待載玻片冷卻后，用自來(lái)水沖洗 ? 復(fù)染：用番茄紅染色液染色 1min。用試管夾夾住載玻片在火焰上加熱約 5min（當(dāng)染料冒蒸汽時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)）。水洗后，再用一種呈紅色的堿性染料復(fù)染 使菌體和芽孢呈現(xiàn)不同的顏色。染色 完畢，用自來(lái)水沖洗。 結(jié)果記錄： 菌種 菌體顏色 菌體形態(tài) G+ 或 G 大腸埃希氏菌 金黃色葡萄球菌 細(xì)菌未知種 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－芽孢染色法 原理： 細(xì)菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁較厚，對(duì)染料的透性差，不易著色，但 是一旦著色又難以脫色。用水沖洗后，應(yīng)甩去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)） ? 顯微鏡觀察：紫和紅好象都是，焦距調(diào)的稍近時(shí)紫色，調(diào)的稍遠(yuǎn)時(shí)紅色，兩種情況下形狀都看的挺清楚，桿狀。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－簡(jiǎn)單染色方法 菌名 染色液名稱 菌體顏色 菌體形態(tài)（圖示） 大腸埃希氏菌 金黃色葡萄球菌 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－革蘭氏染色法 陽(yáng)性菌 陰性菌 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－革蘭氏染色法 注意事項(xiàng)： ? 單一菌落染色后看到紅色桿菌和紫色桿菌共存的情況，特別明顯既有紅色的，也有紫色的？（ 脫色時(shí)間 ：受涂片之厚薄、脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因剛果紅經(jīng)酸性酒精處理后，涂片的背景便從紅色（鹽類的顏色）轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色（即剛果紅游離的顏色），這樣可使對(duì)比性更為鮮明。 ? 負(fù)染色法 ：負(fù)染色法是一種特殊的染色方法，是指背景著色而細(xì)菌本身不著色。 ? 復(fù)染色法 ：主要的復(fù)雜染色法有革蘭氏法和抗酸性及特殊染色法。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－染色分類 ? 單染色法 ：用一種染色劑對(duì)涂片進(jìn)行染色。 ? 為避免因菌數(shù)過(guò)多聚成團(tuán)而不利于觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片一端加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層。 ? 固定 ：標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快地來(lái)回通過(guò)3～ 4次，共 2～ 3s，并不時(shí)以載玻片的加熱面觸及皮膚，其 目的 ：殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)；保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，防止標(biāo)本被水洗掉；改變?nèi)玖蠈?duì)細(xì)胞的通透性，因?yàn)樗兰?xì)胞的原生質(zhì)比活細(xì)胞的原生質(zhì)易于染色。涂布要均勻，菌體間少重疊。 ? 單純?nèi)玖希?不能與被染物生成鹽類 影響染色的因素 ? 細(xì)菌的結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小 ? 培養(yǎng)基：組成、菌齡、 pH 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－制片方法 制片： （制片是染色的關(guān)鍵，如不注意菌體涂布的均勻度，會(huì)造成染料的大面積堆積，而使觀察結(jié)果不理想） ? 制片： 在干凈的載波片（平時(shí)放在 95%酒精中 )上滴一滴蒸餾水或無(wú)菌水，用接種工具進(jìn)行無(wú)菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中與水混合做成懸液，并涂成直徑約 1cm的薄層。（伊紅、剛果紅） ? 堿性染料 （陽(yáng)離子染料）：與帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合， 細(xì)菌一般帶負(fù)電，所以細(xì)菌染色所用的染料，常用堿性染料（堿性復(fù)紅、美藍(lán)）。 菌名 懸滴法或水封片法 細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方式 判斷有、無(wú)鞭毛 普通變形桿菌 銅綠假單胞菌 黃色金葡萄球菌 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－染料 細(xì)菌染色用的染料 ? 酸性染料 （陰離子染料）：染色離子帶陰電荷，能與帶陽(yáng)電的物質(zhì)結(jié)合，使之著色。 ? 鏡檢：先用低倍鏡觀察，然后再轉(zhuǎn)至高倍鏡或油鏡下觀察，觀察的要求同懸滴法。鏡檢時(shí)要仔細(xì)辨別是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)還是分子運(yùn)動(dòng)（即布朗運(yùn)動(dòng)） 不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－壓滴法（水封片法） ? 制水封片：加 1滴菌液于潔凈無(wú)油的載玻片中央，然后取 1滴潔凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，再慢慢地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。 ? 鏡檢： 先用低倍鏡找到標(biāo)記，再稍移凹玻片即可找到菌懸滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央。 ? 滴加菌液： 加 1滴菌液于蓋玻片的中央，并用削尖的記號(hào)筆在菌液的邊緣做一記號(hào)，以便在顯微鏡觀察時(shí)，易于尋找菌液的位置。 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) ? 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容 ：菌體形態(tài)、大小、排列、特殊結(jié)構(gòu) ? 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法 ：不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法和染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 ? 不染色的細(xì)菌標(biāo)本的鏡檢可直接觀察到細(xì)菌活體的形態(tài)、大小、運(yùn)動(dòng)（了解菌是否有鞭毛） ? 懸滴法和壓滴法 不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－懸滴法 ? 制備菌液 ：從幼齡菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌于盛有 1－ 2ml無(wú)菌水的試管中，制成輕度渾濁的菌懸液。 ?無(wú)菌間只允許放置無(wú)菌操作臺(tái)、轉(zhuǎn)椅、水浴鍋；無(wú)菌操作臺(tái)上最多只允許擺放以下物品： 物 品 數(shù) 量 物 品 數(shù) 量 酒精燈 1個(gè) 滅菌 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 200ml 打火機(jī) 1個(gè) 滅菌 雙料發(fā)酵管 6根 接種針 1個(gè) 滅菌 單料發(fā)酵管 12根 消毒面團(tuán) 1瓶 滅菌 平皿 10塊 洗耳球 1個(gè) 試管架 2副 鑷子 1個(gè) 2ml滅菌吸管 5根 油筆 1支 10ml滅菌吸管 3根 試管簍 2個(gè) 125ml滅菌燒杯 2個(gè) 微生物檢測(cè)作業(yè)規(guī)范 ?微生物培養(yǎng) 24小時(shí)后，當(dāng)班微檢員仔細(xì)觀察、如實(shí)填寫(xiě)培養(yǎng)的現(xiàn)象，任何異常情況都必須及時(shí)報(bào)告；晚班的微檢員可將有異常情況的培養(yǎng)液交接給白班，并保證其免受污染。 ?完成作業(yè)后，立即做好相關(guān)標(biāo)識(shí)、填寫(xiě) 《 微生物檢驗(yàn)培養(yǎng)登記表 》 ，然后清理無(wú)菌間。 ?進(jìn)入無(wú)菌間作業(yè)時(shí)必須做到： ?緩沖間、無(wú)菌間的紫外燈開(kāi)啟時(shí)間超過(guò)半小時(shí)； ?關(guān)閉紫外燈后，微檢員把作業(yè)過(guò)程中將用到的所有物品放在緩沖間，同時(shí)在緩沖間更換專用的工作衣，同時(shí)佩戴口罩和衛(wèi)生帽，然后再將物品轉(zhuǎn)移到無(wú)菌間； ?作業(yè)時(shí)關(guān)閉紫外燈、空調(diào)、和無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)；每次最多做 4個(gè)樣品。殺菌時(shí)間由當(dāng)班微檢員用油筆直接寫(xiě)在瓶體。 ?已殺菌未開(kāi)封的培養(yǎng)液在 24小時(shí)內(nèi)可直接使用；已殺菌未開(kāi)封超過(guò) 24小時(shí)或者已殺菌但開(kāi)封而未用完的培養(yǎng)液都必須重新殺菌后使用。 ? 取樣結(jié)束后，先用毛刷刷去潔凈工作區(qū)的雜物和浮塵 ‘ 、用細(xì)軟布擦拭工作臺(tái)表面污跡、污垢目測(cè)無(wú)清潔劑殘留，用清潔布擦干；要經(jīng)常用紗布沾上酒精將紫外線殺菌燈表面擦干凈 ,保持表面清潔 ,否則會(huì)影響殺菌能力；設(shè)備內(nèi)外表面應(yīng)該光亮整潔，沒(méi)有污跡。 ? 每月進(jìn)行一次維護(hù)檢查，并填寫(xiě)維護(hù)記錄 。 ? 最后開(kāi)啟工作臺(tái)紫外燈，照射消毒 30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，切斷電源。 超凈工作臺(tái)的使用 ? 使用工作臺(tái)時(shí)，先經(jīng)過(guò)清潔液浸泡的紗布擦拭臺(tái)面，然后用消毒劑擦拭消毒。 ? 化驗(yàn)室應(yīng)建立可行的規(guī)章制度 ：化驗(yàn)室人員工作管理制度、標(biāo)準(zhǔn)管理制度、危險(xiǎn)化學(xué)試劑的管理制度 、檢驗(yàn)過(guò)程的管理制度 檢測(cè)設(shè)備檢定管理制度 檢驗(yàn)室建設(shè)布局圖 6 6， ，放高壓滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、電熱板等 微生物實(shí)驗(yàn)室主要設(shè)備和器具 ? 無(wú)菌室（接種室）或接種箱 ? 恒溫箱 ? 電烘箱（干燥箱） ? 冰箱 ? 高壓蒸汽滅菌鍋 ? 離心機(jī) ? 接種針 ? 天平 ? 酒精燈 ? 顯微鏡 ? 常用玻璃器皿 ? 均質(zhì)器、試管夾，吸管，移液槍，脫脂棉，牛皮紙，棉繩，紗布，剪刀 無(wú)菌室建設(shè) 新建無(wú)菌室的處理程序 ? 先用 3%的煤酚皂擦洗工作臺(tái)面及地面，再用甲醛加高錳酸鉀熏蒸空氣。使用電爐或酒精燈加熱時(shí)應(yīng)堅(jiān)持有人看管和監(jiān)視。 (2)常溫與熱源設(shè)備分開(kāi)：熱源儀器（如電熱蒸餾水器、恒溫干燥箱、高溫電阻爐、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、電爐等）必須與其它一切設(shè)備分開(kāi)，不然會(huì)影響其它設(shè)備的正常使用，嚴(yán)重的會(huì)造成熱蒸汽腐蝕其它設(shè)備，影響其使用壽命。其次還應(yīng)必須有上下水設(shè)施、通風(fēng)櫥（在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行對(duì)發(fā)生出有害氣體的分析操作）。 （ 4）所有電器插坐均應(yīng)有牢固的地線裝置，以防止設(shè)備帶電，造成操作人員觸電事故。 （ 2）室內(nèi)應(yīng)有足夠的照明條件。但是，最小建筑面積：理化檢驗(yàn)室不能小于 30平方米；微生物檢驗(yàn)室（無(wú)菌室）不能小于 8平方米。 檢驗(yàn)室建設(shè)要求 ? 選址與規(guī)模 （ 1）化驗(yàn)室應(yīng)建設(shè)在遠(yuǎn)離粉塵、噪聲、散發(fā)異味氣體等地點(diǎn)，電源電壓應(yīng)當(dāng)相