【正文】 ? 取清潔無油的血球計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)室上面加蓋玻片。 ? 取酵母菌液，搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。 ? 靜止 5min后，用低倍鏡觀察并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。 ? 高倍鏡下計(jì)數(shù)：隨機(jī)計(jì)數(shù)五個(gè)中格的平均值，然后求得每個(gè)中格的平均值。乘上 16（或 25）就得出一大格中的總菌數(shù)，最后再換算到每 mL菌液中的含菌數(shù)。 ? 計(jì)算方法： ? 注意事項(xiàng)：壓在方格線上的菌體，以壓在底線和右側(cè)線上的菌體計(jì)入本格內(nèi)；遇到有芽體的酵母時(shí)，若芽體和母體同等大，就按單個(gè)酵母計(jì)數(shù)。 ? 計(jì)數(shù)完畢后，血球計(jì)數(shù)板要立即清洗干凈，并用吸水紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內(nèi)。 （ X1+X2+X3+X4+X5） 5 25（ 或 16） 10 1000 稀釋倍數(shù) 酵母菌細(xì)胞數(shù) /mL= 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 微生物保藏方法 ? 斜面冰箱保藏法： 將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長(zhǎng)出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長(zhǎng)出孢子，貼上標(biāo)簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入 40C冰箱中保藏。一般每隔 3個(gè)月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植 1次。方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)室均采用。 缺點(diǎn)：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化 。 ? 石蠟封藏法： 在已長(zhǎng)好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面 1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細(xì)菌和放線菌。 石蠟的處理： 250mL三角瓶裝 100mL液體石蠟， ，然后放在 1050C左右的烘箱中 1h，使水分蒸發(fā)掉。 ? 砂土管保藏法： (可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細(xì)菌）。 ： 取河沙若干，用 40目過篩，出去大顆粒，加 10％ HCl后煮沸 30min，除去有機(jī)質(zhì)（也可用 10％ HCl浸泡 2— 4h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取 ，曬干磨細(xì)，過 120目篩。 土：砂＝ 1： 4 的比例均勻混合，裝入指形管中，以 1cm高為宜，塞上棉塞， 160～1700C干熱滅菌 2h。 3mL左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取～ ，用接種環(huán)拌勻，并貼上標(biāo)簽，注明菌名。 ，立即進(jìn)行抽真空干燥，要求在 24h內(nèi)抽干，尤其是夏天要求較短時(shí)間內(nèi)抽干。搖散砂土，放干燥器內(nèi)冰箱保藏。 冷凍真空干燥保藏法： 此法一般常用于細(xì)菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護(hù)劑 。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 微生物生化反應(yīng) 生化反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。 糖酵解試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn) VP試驗(yàn) 甲基紅（ Methyl Red） 試驗(yàn) 靛基質(zhì)（ Imdole） 試驗(yàn) 枸椽酸鹽試驗(yàn)： 尿素酶（ Urease） 試驗(yàn) 三糖鐵（ TSI） 瓊脂試驗(yàn) 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 糖酵解試驗(yàn) 不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 淀粉水解試驗(yàn) 某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 乙酰甲基甲醇 （ VP） 試驗(yàn) 某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱 V－ P（ +） 反應(yīng)。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 甲基紅（ MR）試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基 PH值下降至 ，使甲基紅指示劑變紅。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 靛基質(zhì)（ 吲哚 ）試驗(yàn) 某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 檸檬酸鹽試驗(yàn) 某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 尿素酶（ Urease）試驗(yàn) 有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生 2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。 未接種 尿素酶陽性 尿素酶陰性 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 三糖鐵（ TSI）瓊脂試驗(yàn) 本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。 a. uninoculated b. little change/alkaline// c. alkaline/acid//+ d. acid/acid/+/+ e. acid/acid/+/ 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 －－ 沙門氏菌的 TSI試驗(yàn) 食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)一般檢驗(yàn)技術(shù) 學(xué)習(xí)目標(biāo)： ? 熟悉微生物檢驗(yàn)的基本程序和要求； ? 掌握食品微生物檢驗(yàn)中常見檢樣的制備技術(shù)； ? 熟悉食品微生物檢驗(yàn)中細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群數(shù)的檢驗(yàn)程序； ? 熟悉掌握食品微生物檢驗(yàn)中細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群數(shù)檢測(cè)的操作技術(shù)，并能獲得正確的檢驗(yàn)結(jié)果，寫出規(guī)范的檢驗(yàn)報(bào)告。 食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)一般檢驗(yàn)技術(shù) 食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的目的，是要對(duì)食品進(jìn)行細(xì)菌衛(wèi)生評(píng)價(jià)。 這就要求檢驗(yàn)人員在求實(shí)的精神下，科學(xué)地進(jìn)行被檢對(duì)象的采樣、樣 品送檢、檢樣處理、檢驗(yàn)以及報(bào)告。在整個(gè)過程中，不得摻雜檢驗(yàn)人 員的絲毫主觀臆想和工作上的馬虎，要有章可依地進(jìn)行檢驗(yàn)和報(bào)告。 樣品的采樣 → 送檢 → 樣品的處理 → 檢驗(yàn)與報(bào)告 食品微生物檢樣的采集 ? 樣品種類 樣品可分大樣、中樣、小樣三種。大樣是指一整批樣品；中樣是指從樣品各部分 取得的混合樣品，定型包裝及散裝食品均采樣及散裝食品均采樣 250g；小樣系 指分析用的樣品，又稱為檢樣，檢樣一般為 25g。 ? 采樣的方法 根據(jù)樣品，如袋裝、瓶裝或罐裝食品，應(yīng)采用完整的未開封的樣品；檢樣是冷凍 食品，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)（可放在冰內(nèi)、冰箱的冰盒內(nèi)或低溫冰箱保存），非冷凍 食品需在 0～ 5℃ 中保存。 （ 1）液體樣品的采樣：將樣品充分混勻，無菌操作開啟包裝，用 100ml無菌注射器抽取，放入無菌容器。 （ 2）半固體樣品的采樣：無菌操作開啟包裝，用滅菌勺子從幾個(gè)部位挖取樣品，放入無菌容器。 （ 3）固體樣品的采樣：大塊整體食品應(yīng)用無菌刀具和鑷子從不同部位取樣，應(yīng)兼顧表面和深度，注意樣品代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。樣品是固體粉末，應(yīng)邊取樣邊混合。 食品微生物檢樣的采集 （ 4）冷凍食品的采樣：大包裝小塊冷凍食品的采樣按小塊個(gè)體采??；大塊冷凍 食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從冷凍上鋸取樣品，也可以用無菌鉆頭鉆取碎樣品，放入無菌容器。 注：固體樣品或冷凍食品取樣還應(yīng)注意檢樣目的，若需檢驗(yàn)食品污染情況，可取表層樣品；若需檢驗(yàn)其品質(zhì)情況，應(yīng)再取深部樣品。 （ 5）生產(chǎn)工序監(jiān)測(cè)采樣 ? 車間用水：自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水，湯料從車間容器不同部位用 100ml無菌注射器抽取。 ? 車間臺(tái)面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)：用板孔 5cm2無菌采樣板及 5支無菌擦拭 25cm2面積。 ? 車間空氣采樣：將 5個(gè)直徑 90mm的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋 5min，然后蓋上平板送檢。 食品微生物檢樣的采集 ? 采樣的數(shù)量 ? 采樣的標(biāo)簽：采樣前或后應(yīng)立即貼上標(biāo)簽，每件樣品必須標(biāo)記清楚，如品名、來源、數(shù)量、采樣地點(diǎn)、采樣人及采樣時(shí)間（年、月、日） ? 取樣注意事項(xiàng)： ? 防止交叉污染或二次污染： 取樣人員的個(gè)人衛(wèi)生控制 ；取樣地點(diǎn)的環(huán)境控制，空氣凈化要達(dá)到要求；取樣的器皿要求徹底消毒，避免直接與空氣接觸 ；取樣的操作要規(guī)范、迅速（無菌操作） ；減少樣品存放的時(shí)間（保持樣本原有的狀態(tài)、易變質(zhì)的樣本要冷藏） ? 取樣要有代表性： 取樣的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)；取樣的方法 采樣所出的問題 食品微生物檢驗(yàn)的樣品送檢 采樣后，在送檢過程中，要盡可能保持檢樣原有的物理和微生物狀態(tài)，不要因送檢過程而引起微生物的減少或增多。 ? 無菌方法采樣后，所裝樣品的容器要無菌，裝樣后盡可能密封，以防止環(huán)境中的微生物進(jìn)一步污染； ? 進(jìn)行微生物檢驗(yàn)的樣品，送達(dá)實(shí)驗(yàn)室要越快越好，一般不應(yīng)超過 3h。若路途遙遠(yuǎn)，可將不需冷凍的樣品，保持在 1～ 5 ℃ 環(huán)境中送檢，可采用冰桶等裝置；若需保持在冷凍狀態(tài)（如已冰凍的樣品），則需將樣品保存在泡沫塑料隔熱箱內(nèi)，箱內(nèi)可置干冰，使溫度維持在 0℃ 以下，或采用其他冷藏設(shè)備； ? 送檢樣品不得加入任何防腐劑； ? 水產(chǎn)品因含水分較多，體內(nèi)酶的活力較旺盛，易于變質(zhì)。因此，采樣后應(yīng)在3h內(nèi)送檢，在送檢途中一般都應(yīng)加冰保存； ? 對(duì)于某些易死亡病原菌檢驗(yàn)的樣品，在運(yùn)送過程中可采用運(yùn)送培養(yǎng)基。 ? 檢樣標(biāo)注適當(dāng)?shù)臉?biāo)記并填寫微生物學(xué)檢驗(yàn)特殊要求的送檢申請(qǐng)單。其內(nèi)容包括：樣品的描述，采樣者的姓名，采樣的日期、時(shí)間、地點(diǎn)，采樣時(shí)的溫度和濕度等 食品微生物檢驗(yàn)的樣品處理 不同食品的處理方法 樣品處理的問題 食品微生物檢驗(yàn)的檢驗(yàn)與報(bào)告 ? 檢驗(yàn)：檢驗(yàn)樣品送到實(shí)驗(yàn)室后，立即將樣品置于普通冰箱或低溫冰箱中，并進(jìn)行登記、填寫實(shí)驗(yàn)序號(hào)，按檢樣檢樣要求，積極準(zhǔn)備條件進(jìn)行檢驗(yàn)。樣品收集后應(yīng)于 36h內(nèi)檢驗(yàn)； ? 報(bào)告：按樣品項(xiàng)目完成各類檢驗(yàn)后，檢驗(yàn)人員應(yīng)及時(shí)填寫檢驗(yàn)報(bào)告單，簽名后送主管人員簽字，加蓋單位印章，以示生效，立即交食品衛(wèi)生監(jiān)督人員處理； 實(shí)驗(yàn)室必須具有專用冰箱存放樣品，對(duì)于一般陽性樣品，在發(fā)出報(bào)告 3天（特殊情況可適當(dāng)延長(zhǎng)）方可處理樣品；進(jìn)口食品的陽性樣品，需保存 6個(gè)月，才可處理；而對(duì)于陰性樣品可及時(shí)處理。 食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中常見檢樣的制備 ? 肉與肉制品檢樣的制備 ? 乳與乳制品檢樣的制備 ? 蛋與蛋制品檢樣的制備 ? 水產(chǎn)品檢樣的制備 ? 飲料、冷凍飲品檢樣的制備 ? 調(diào)味料檢樣的制備 ? 糖果、糕點(diǎn)和蜜餞檢樣的制備 ? 酒類檢樣的制備 ? 方便面（速食米粉）檢樣的制備 ? 罐藏食品檢樣的制備 菌落總數(shù)的測(cè)定 －－測(cè)定方法 ? 標(biāo)準(zhǔn)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） ? 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 ? 菌落總數(shù)快速檢測(cè)紙片 ? 電阻抗法測(cè)定食品中細(xì)菌總數(shù) 菌落總數(shù)的測(cè)定 －－平板菌落計(jì)數(shù)法 程序 菌落計(jì)數(shù) 選擇 2～ 3個(gè)適當(dāng)稀釋度懸液各 1ml，加入無菌空培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做 2～ 3個(gè)培養(yǎng)皿 用生理鹽水進(jìn)行無菌稀釋，做成幾個(gè)適當(dāng)稀釋倍數(shù)的懸液 每個(gè)培養(yǎng)皿中傾注約 45℃ 左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂或肉湯瓊脂培養(yǎng)基，冷卻后，于 37℃ 培養(yǎng) 24h 被檢樣品 報(bào)告結(jié)果 ↓ ↓菌落總數(shù)的測(cè)定 －－平板菌落計(jì)數(shù)法 操作要點(diǎn) ? 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基置于 45 ℃ 恒溫水浴鍋中保溫備用。 ? 編號(hào) :無菌試管（ 101 、 102 、 103 、 104。 ）、無菌培養(yǎng)皿、空白對(duì)照平板 ? 稀釋菌液： ? 搖勻平板：平板前后、左右或者以順時(shí)針、逆時(shí)針。 ? 倒