【正文】 基因小鼠進(jìn)行近親繁殖。Date 139用 founder動(dòng)物與已知的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配，產(chǎn)生 F1代后，再經(jīng)過基因整合和表達(dá)的檢測，證明轉(zhuǎn)入的基因可以遺傳給后代，并且在后代中得到表達(dá)，才能宣布獲得了真正意義上的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。常用 PCR進(jìn)行篩選提取鼠尾 DNA PCR檢測出陽性第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 138第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（ founder）只能算作過渡材料有很大一部分 founder都屬于嵌合體，由轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因兩種細(xì)胞組成。RNA水平 blot、免疫組化 、病理、 ELISA、 Dotblot。shouthernDate 131第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟BAC以 ，轉(zhuǎn)化效率較高，常規(guī)方法 (堿裂解 )即可分離 BAC：藍(lán)白斑，抗生素，菌落原位雜交等均可用于目的基因篩選；可對(duì)克隆在 BAC的 DNA直接測序Date 132Date 133第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟轉(zhuǎn)入基因的整合、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定外源基因?qū)牒蟮拇嬖诜绞诫S機(jī)整合（非同源重組）定點(diǎn)整合（同源重組） 。Date 126Date 127Date 128Date 129第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC的缺點(diǎn)：內(nèi)部存在嵌合及重組等現(xiàn)象，即在一個(gè)YAC克隆里含有兩個(gè)本來不相連的獨(dú)立片段；某些克隆不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)缺失或重排其中的片段 ；此外，由于 YAC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)，因此 YAC很難與酵母染色體區(qū)分開，并且在轉(zhuǎn)基因操作時(shí)必須特別小心 ,以防染色體機(jī)械切割。3）自主復(fù)制序列（ ARS）元件：是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。YAC載體的裝載量為 350 400 kbDate 125第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC 的主要功能成份有三：1）著絲粒： mitosis姊妹染色單體和減 I同源染色體分離之必需。Date 124第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC：基于 ARS、 CEN、 TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能序列 ,人們利用這些序列構(gòu)建載體 , 重組后的 DNA以線性狀態(tài)存在 , 這樣不僅穩(wěn)定 ,而且大大提高了插入外源基因的能力 , 并且可以像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工染色體。Date 123第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC和 BAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移酵母人工染色體（ YAC）載體是近年來發(fā)展起來的新型載體 , 能克隆百萬對(duì)堿基的大片段 DNA。Date 121外源 DNA導(dǎo)入精細(xì)胞的方法有 DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。Date 119第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟缺點(diǎn)：技術(shù)上難度大，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實(shí)驗(yàn)室可以開展。Date 117Date 118第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后，用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率，不僅具有“ ES細(xì)胞途徑 ” 的全部優(yōu)點(diǎn)，且物種適用面廣。Date 113第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟步驟： DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化Date 114Date 115Date 116第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟體細(xì)胞核移植法（轉(zhuǎn)基因＋克?。w細(xì)胞核移植法（轉(zhuǎn)基因＋克隆） 將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植（把體細(xì)胞核植入一胞核進(jìn)行核移植（把體細(xì)胞核植入一個(gè)去了核的卵母細(xì)胞中，融合并激活個(gè)去了核的卵母細(xì)胞中，融合并激活），將重組胚進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入），將重組胚進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動(dòng)物的輸卵管。第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 108ψ包裝質(zhì)粒包膜質(zhì)粒Date 109Date 110第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)： 受精卵攜帶外源基因的陽性率高；外源基因多單拷貝整合；操作簡單，避免注射法對(duì)卵子的損害；宿主范圍廣；可同時(shí)感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高Date 111第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟缺點(diǎn)： 容納大小有限（ ≤ 10kb）；潛在致癌性 ,載體復(fù)雜；整合率不高 ,胚胎自我保護(hù)機(jī)制對(duì)其有抗性Date 112第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟存在問題：重組病毒的滴度還不夠高，均在 101TU/ml～103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；建立穩(wěn)定的 HIV載體包裝細(xì)胞十分困 難，已建立的包裝細(xì)胞均不理想。通常分為兩質(zhì)粒和三質(zhì)粒系統(tǒng)兩種。第三代慢病毒載體又進(jìn)一步做了些安全方面的改進(jìn)，如刪除了 U3區(qū)的3′LTR 和 tat基因，將 rev基因分離稱為四質(zhì)粒系統(tǒng)Date 107病毒載體系統(tǒng)中，病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，也就是假型病毒。nef,負(fù)因子，具有抑制 HIV1增殖作用Date 105慢病毒載體的發(fā)展經(jīng)歷了 3個(gè)階段第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表。vpu,Vpr,病毒感染因子 ,病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，能增加 gag和 env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)? ? 及 gp41；? 多聚酶基因，編碼多聚酶；? ? Date 101Date 102Date 103Date 104? gag,其中研究最多最為透徹的是 HIV。immunodeficiencySIVimmunodeficiencyFIVvirus） infectiousEIAVimmunodeficiency第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 98Date 99Date 100第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟HIV攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉(zhuǎn)移載體。Date 96第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟慢病毒（ Lentiviruses）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。 此法理論上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不穩(wěn)定，有待繼續(xù)探索、完善。Date 92第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性　外源基因?qū)?ES細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便Date 93第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持 ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體Date 94第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟生殖細(xì)胞載體法 有體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染生殖細(xì)胞的兩種方法，前者又包括 精子載體法 、 卵子載體法 、 受精卵載體法 、胞漿內(nèi)精子注射法 等。Date 89第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟步驟：分離 ES細(xì)胞將包含目的基因載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入 ES細(xì)胞體外培養(yǎng)篩選陽性克隆陽性克隆轉(zhuǎn)入受體囊胚并移植入假孕養(yǎng)母子宮子代嵌合體的鑒定， 雜交 生成純合子Date 90Date 91囊胚固定 cellderivedgenome.UterinetransmissionofwhitetowhitemouseMotherXChimeraBlastocystPregnantintoESESPopulationEScellDate 82第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)：它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。Date 80第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：外源 DNA大小基本不受限制（ 150kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高；不依賴載體缺點(diǎn)：儀器貴重，技術(shù)要求高，效率低，隨機(jī)整合，卵細(xì)胞傷害大，胚胎易損傷Date 81第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟胚胎干細(xì)胞（ ES）法： （ ES細(xì)胞， Embryo　 stem　 cell）是指囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中尚未進(jìn)行分化的細(xì)胞，這種細(xì)胞具有類似癌細(xì)胞無限繁殖 和 高度分化 的潛能。Date 78Date 79第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟用顯微注射方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，操作技術(shù)性很強(qiáng)，即使是受過嚴(yán)格訓(xùn)練的專業(yè)人員操作，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的受精卵也只占注射卵的 5％。 第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 75Date 76Date 77? 在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸取胚胎，次序?yàn)槭炗?、空氣?培養(yǎng)液、空氣泡 胚胎 (盡可能少帶入培養(yǎng)液 )。手術(shù)切口位于兩側(cè)腰部距背正中線 1 cm處，左右各一個(gè)相互平行的切口。第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟沖卵Date 72然后，用鑷子輕輕夾住傘口下部位，慢慢將沖卵針插入傘口，再用鑷子輕輕夾住針頭，推壓注射器，胚胎從另一端沖出。此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)脫掉，可用1ml的注射器自輸卵管傘口沖得胚胎。用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán)Date 70Date 71第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 67Date 68Date 69第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 64Date 65計(jì)算時(shí)間與結(jié)扎公鼠Date 66 （ 1）受精卵的收集和處理 見栓當(dāng)日的胚胎處于 1細(xì)胞期。? 將注射 HCG后的母鼠與 正常公鼠 合籠，并于第二天早上檢查陰道栓，如果見栓說明已經(jīng)配上種了，計(jì)做懷孕 0天。供體母鼠（不動(dòng)情的 25g母鼠）腹腔注射 PMSG術(shù)后 2～ 3周即完全康復(fù)，可用其生產(chǎn)假孕母鼠。DivisionGestationBirthEmbryoRecoveryE1 E2 E211 2 3 4 5hCGPMSDate 59AM 12AM 12AM 12TransgenesisDAYFertilization12PipetteDate 58EventsembryoHoldingTransfer++2cellFostersuperovulate?+stagemouseDate 57X1cell 轉(zhuǎn)基因受精卵在單細(xì)胞至桑椹胚階段移植到受孕后 母鼠的輸卵管，在囊胚