【正文】 四 )根據(jù)物質分子大小差別進行分離 (1)葡聚糖凝膠：系由平均分子量一定的葡聚糖及交聯(lián)劑 (如環(huán)氧氯丙烷 )交聯(lián)聚合而成。一般，分離條件一定時， Ve重現(xiàn)性很好，可用來表示物質的洗脫性質。 M越大，則 Ve越??； M越小，則 Ve越大。假定從柱上加入試樣算起，至某個組分集中流出時所需溶劑體積為Ve(稱為洗脫體積 )，則 Ve與組分分子量之間有下列關系。 92 (四 )根據(jù)物質分子大小差別進行分離 1．凝膠濾過法分離物質的原理 當在水中充分膨脹后裝入色譜柱中，加入試樣混合物，用同一溶劑洗脫時，由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內部 (即被排阻在凝膠粒子外部 )，故在顆粒間隙移動，并隨溶劑一起從柱底先行流出；小分子因可自由滲入并擴散到凝膠顆粒內部，故通過色譜柱時阻力增大、流速變緩，將較晚流出。 91 (四 )根據(jù)物質分子大小差別進行分離 1．凝膠濾過法分離物質的原理 凝膠濾過法 (Gel filtration)也叫凝膠滲透色譜(Gelpermeation chromatography)、分子篩濾過 (molecular sieve filtration)、排阻色譜 (exclusion chroma—tography)，系利用分子篩分離物質的一種方法。以上這些方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白質、核酸、多糖類的脫鹽精制及分離工作，對分離小分子化合物來說不太適用。常用的有透析法、凝膠濾過法、超濾法、超速離心法等。 一般上樣后先用水（或酸、堿水）洗去雜質，然后用不同濃度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脫。對非極性大孔樹脂，洗脫液極性越小，洗脫能力越強。 88 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (4)洗脫液的選擇：洗脫液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。市售大孔樹脂一般含有未聚合的單體、致孔劑 (多為長碳鏈的脂肪醇類 )、分散劑和防腐劑等，使用前必須經(jīng)過處理。 87 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (3)大孔吸附樹脂的應用：大孔吸附樹脂現(xiàn)在已被廣泛應用于天然化合物的分離和富集工作中，如苷與糖類的分離、生物堿的精制。 被分離物質的極性大先流出色譜柱 。另外，能與大孔吸附樹脂形成氫鍵的化合物易被吸附。化合物的分子量、極性、能否形成氫鍵等都影響其與大孔吸附樹脂的吸附作用。例如用非極性大孔吸附樹脂對生物堿的 O． 5％鹽酸溶液進行吸附，其吸附作用很弱，極易被水洗脫下來，生物堿回收率很高。溶劑的性質是另一個影響因素。糖是極性的水溶性化合物，與 D型非極性樹脂吸附作用很弱。 85 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (2)影響吸附的因素：比表面積、表面電性、能否與化合物形成氫鍵等是影響吸附的重要因素。 84 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 吸附原理： ① 吸附性：大孔吸附樹脂本身具有吸附性 ，是由范德華力或氫鍵吸附的結果 。 ③ 吸附速度快 。 83 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 特性： ① 理化性質穩(wěn)定 ， 不容于酸 、 堿及有機溶劑 。 82 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (1)大孔吸附樹脂的吸附原理：大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩性原理相結合的分離材料，它的吸附性是由于 范德華引力 或產(chǎn)生氫鍵的結果。因其理化性質穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶媒中，所以在天然化合物的分離與富集工作中被廣泛應用。 聚酰胺色譜也有薄層色譜與柱色譜兩種方式。此外，對生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離也有著廣泛的用途。常用的聚酰胺再生劑有1O％醋酸、 3％氨水及 5％氫氧化鈉水溶液等。甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中均有酰胺基，可以同時與聚酰胺及酚類等化合物形成氫鍵締合，故有很強的洗脫能力。顯然， 聚酰與酚類或醌類等化合物形成氫鍵締合的能力在水中最強， 在含醇中則隨著醇濃度的增高而相應減弱，在高濃度醇或其它有機溶劑中則幾乎不締合。 78 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 以上是僅就化合物本身對聚酰的親和力而言。易形成分子內氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附即相應減弱。 74 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 聚酰胺吸附色譜的原理 75 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 ① 形成氫鍵的基團數(shù)目越多，則吸附能力越強。 72 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 5．聚酰胺吸附色譜法 聚酰胺 (poliamide)吸附屬于 氫鍵 吸附，是一種用途十分廣泛的分離方法，極性物質與非極性物質均可適用，但特別適合分離酚類、醌類、黃酮類化合物 73 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (1)聚酰胺的性質及吸附原理：商品聚酰胺均為高分子聚合物質，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有機溶劑，對堿較穩(wěn)定，對酸尤其是無機酸穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。 71 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (5)如液一液分配色譜中所述，吸附柱色譜也可用加壓方式進行，溶劑系統(tǒng)可通過 TLC進行篩選。當然，硅膠、氧化鋁用適當方法處理成中性時，情況會有所緩解。實驗室中最常應用的混合溶劑組合如表 。實踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調節(jié)比例以改變極性，達到梯度洗脫分離物質的目的。如試樣在所選裝柱溶劑中不易溶解，則可將試樣用少量極性稍大溶劑溶解后，再用少量吸附劑拌勻，并在 60℃ 下加熱揮盡溶劑，置 P205真空干燥器中減壓干燥，研粉后再小心鋪在吸附劑柱上。 譜管內徑 (cm)： 10 長度 (cm)： 10 15 30 45 60 75 90 120 150 吸附柱色譜用的硅膠及氧化鋁目前均有市售品，可以過篩選用。試樣極性較小、難以分離者，吸附劑用量可適當提高至試樣量的 1 OO～ 200倍。 66 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 4．吸附柱色譜法用于物質的分離 吸附色譜法中硅膠、氧化鋁柱色譜在實際工作中用得最多。方法為將水浸液 pH調至堿性 ()，分次加入活性炭，攪拌，靜置，直到上清液檢查無生物堿反應時為止。 此外，從大量稀水溶液中濃縮微量物質時，有時也采用簡單吸附方法。但要注意，有時擬除去的色素不一定是親脂性的，故活性炭脫色不一定總能收到良好的效果。 63 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 (3)大體上溶劑極性的大小可以根據(jù)介電常數(shù) (ε)的大小來判斷。以生物堿而言，游離型為非極性化合物，易為活性炭所吸附；但離解型則不然，為極性化合物，不易為活性炭所吸附。又如葡萄糖，因分子中含有許多一 OH基，故為極性化合物，但鼠李糖 (6去氧糖 )及加拿大麻糖 (2,6二去氧糖 )因分子中 CH2 OH及 CHOH分別脫去氧變?yōu)?CH3及 CH2，故極性即隨之降低。以氨基酸來說，分子結構中既有正電基團，又有負電基團，故極性很強。 極性是一種抽象概念，用以表示分子中電荷不對稱 (assymmetry)的程度，并大體上與偶極矩(dipo1emoment)、極化度 (polarizability)及介電常數(shù) (dielectrie constant)等概念相對應。故從活性炭上洗脫被吸附物質時，洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的降低而增強。 57 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 活性炭因為是非極性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對非極性物質具有較強的親和能力，在水中對溶質表現(xiàn)出強的吸附能力。溶劑極性增強，則吸附劑對溶質的吸附能力即隨之減弱。 56 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 硅膠、氧化鋁因均為極性吸附劑，故有以下特點： (1)對極性物質具有較強的親和能力，極性強的溶質將被優(yōu)先吸附。以靜態(tài)吸附來說，當在某中藥提取液中加入吸附劑時，在吸附劑表面即發(fā)生溶質分子與溶劑分子、以及溶質分子相互間對吸附劑表面的爭奪。如采用硅膠、氧化鋁及活性炭為吸附劑進行的吸附色譜即屬于這一類型； 54 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 化學吸附 (chemical adsorption)，如黃酮等酚酸性物質被堿性氧化鋁吸附，或生物堿被酸性硅膠吸附等，因為具有選擇性、吸附十分牢固、有時甚至不可逆，故用得較少； 半化學吸附 (semichemical adsorption)，如聚酰胺對黃酮類、醌類等化合物之間的氫鍵吸附，力量較弱，介于物理吸附與化學吸附之間，也有一定應用。 53 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 物理吸附 (physical adsorption)也叫表面吸附，是因構成溶液的分子 (含溶質及溶劑 )與吸附劑表面分子的分子間力的相互作用所引起。 52 (三 )根據(jù)物質的吸附性差別進行分離 在中藥有效成分分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。 （ 3）欲分離混合物的濃度不宜過高。 * 操作注意： （ 1）先將兩相溶劑相互充分飽和。 49 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 液滴逆流色譜 DCCC裝置示意圖 HSCCC分離物質原理模擬圖 50 * 溶劑分配法中溶劑系統(tǒng)的選擇： 兩相溶劑不相混溶，混合物中各單一成分 在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)差別越大越好。在分離大量試樣時，并可將幾根柱子串聯(lián)使用，以提高分離效果，并且用過的柱子可反復再生多次重復使用，值得推廣普及。 46 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 常用 Lobar柱的型號及可能分離規(guī)模 47 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 Lobar柱可選用耐壓送液泵 (最大不超過 105Pa)或與 HPLC的送液泵聯(lián)用。 44 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 高壓液相色譜裝置的模式圖 A． 溶劑貯槽 B． 高壓液送泵 C． 防止脈沖裝置 D． 色譜柱 E． 進樣閥 F． 檢出裝置 G．記錄裝置 H. 計算機 45 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 近來，中低壓液相柱色譜裝置及 E． Merck公司生產(chǎn)的配套用 Lobar柱因分離規(guī)模較大 (可達克數(shù)量級 )、分離效果較好 (有時不亞于HPLC所得結果 )、分離速度較快 (填充劑顆粒較大，約 40～ 60 μm)、分離條件又可由相應的 TLC結果直接選用，加之價格比較便宜、操作簡便，故很受用戶歡迎。故無論在分離效能及分離速度方面，加壓液相色譜均遠遠超過了經(jīng)典的液．液分配柱色譜方法，在天然藥物分離工作中得到了越來越廣泛的應用。 40 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 表 11 HPLC用 Zorbax系列填充柱 41 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 為了提高分離速度、縮短分離時間，則須施加壓力，且依所用壓力大小不同，可以分為快速色譜 (flash chromatography，約 105 Pa)、低壓液相色譜 (LPLC， 105 Pa)、中壓液相色譜 (MPLC，～ 105 Pa)及高壓液相色譜(HPLC， l05 Pa)等。加壓液相色譜用的載體多為顆粒直徑較小、機械強度及比表面積均大的球形硅膠微粒，如 Zipax類薄殼型或表面多孔型硅球以及 Zorbax類全多孔硅膠微球，其上并鍵合不同極性的有機化合物以適應不同類型分離工作的需要，因而柱效大大提高。 三者親脂性強弱順序如下： RP18RP8RP2。 37 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 常用反相硅膠薄層色譜及柱色譜的填料系將普通硅膠經(jīng)下列方式進行化學修飾，鍵合上長度不同的烴基(R)形成親脂性表面而成。 36 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 除色譜柱外，液一液分配色譜也可在色譜用硅膠薄層色譜上進行。 35 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 (1)正相色譜與反相色譜： 液一液分配柱色譜用的載體主要有硅膠、硅藻土及纖維素粉等。這樣，物質同樣可在兩相溶劑中相對作逆流移動，在移動過程中不斷進行動態(tài)分配而得以分離。設 A、 B兩種(或兩組 )物質的 Rf值分別為 Rfa及 Rfb，則 其中 RfaRfb 據(jù)此，可用 PC選擇設計液．液萃取分離物質的最佳方案 34 （二 )根據(jù)物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 6．液一液分配柱色譜 逆流分溶法分離物質在分液漏斗中或 Craig逆流分溶儀中進行時，前者手工操作，比較費時；后者因儀器自身