凝膠過濾ppt課件-文庫吧資料
2025-05-12 07:55本頁面
【正文】 分辨率 高 。 ? 注 ? 為了除去凝膠顆?？障吨械?氣泡 ： ? 可把處理過的凝膠浸泡于蒸餾水或平衡液中用 抽氣方法 實(shí)現(xiàn) 。 2． 凝膠用量的計(jì)算 ? 根據(jù)層析柱的 體積 和干凝膠的 膨脹度 (見表 62)，按下面的公式可計(jì)算出所需干凝膠的用量： 干凝膠用量（ g） =πr2h / 膨脹度 膨脹度 =床體積 /g ? 用此法計(jì)算出的干凝膠用量還需增加 10％ ~20％ ，因?yàn)槟z在處理過程中會(huì)有一部分損失。 但 細(xì)顆粒 凝膠 流速慢 ， 故宜 用 大直徑 的層析柱 ， 這類凝膠用于小型試驗(yàn) ， 可得到滿意結(jié)果 。 ? (2)粒度 ? 凝膠的粒度有粗有細(xì) (與交聯(lián)度無關(guān) )。 ? 蛋白質(zhì)脫鹽時(shí)，可選用凝膠 SephadexG25。 型號(hào)不同 ， 篩分范圍 亦不相同 。 這些值的大小見圖63。 故可求得某一分離物的 Kav值 =（ VeVo） /（ VtVo） 。 理由是： 該 物質(zhì) 分子質(zhì)量 大 (為 200萬 )， 呈 藍(lán)色 ， 在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻 ， 并可借助本身的顏色 ， 采用 肉眼 或分光光度計(jì)檢測(cè) (在 210nm或260nm、 620nm)洗脫體積 Ve， 即 Ve = Vo 測(cè)定內(nèi)水體積 (Vi) 可選用 硫酸銨 、 N— 乙酰酪氨酸乙酯 ， 或者其他與凝膠無吸附力的 小分子物質(zhì) 。 凝膠床的洗脫體積 Ve剛好等于 外水體積 Vo， 即 : Ve=Vo (Kav=0) 溶液中的分子 小于 凝膠孔徑 下限者 ， 能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)； 凝膠床的洗脫體積 Ve應(yīng)等于 凝膠床總體積 , 即 : Ve=Vt=Vo+Vi (Kav=1) 則 : Vi=VeVo 溶液中的分子大小 介于 凝膠孔徑上限和下限 之間者 ， 則有一部分能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔 ， 故其洗脫體積 Ve是在 Vo和 Vt之間 (Kav在 0～ 1之間 )。 ? 凝膠床總體積 Vt的求得 有如下 2種方法可求得 Vt 根據(jù)層析柱體積計(jì)算總體積 ， 可用下列公式表示 Vt =πr2h 式中 , r為層析柱半徑； h為凝膠床高度； π為圓周率 。 Kav值 差異性 大 ， 分離效果 好 ； Kav值差異性 小 ，乃至等于 1或等于零 (即使樣品中各組分的分子質(zhì)量相差很大 )，則分離效果 很差 ，或根本不能分開。 (見圖 62) 流出物分管 等量 或 等時(shí) 地 收集 ， 檢測(cè) 后 分段 合并 相同組分 的各管流出物，把分子質(zhì)量不同的物質(zhì)相互 篩分開 了。 ? 分離過程 在同一凝膠過濾柱上 分子質(zhì)量不同 的混合物質(zhì)，由于流動(dòng)相的作用，這些物質(zhì)將發(fā)生 排阻 和 擴(kuò)散 效應(yīng) 。 即 : Kav=（ VeVo） /（ VtVo） ? 在限定的層析條件下 ， Vt和 Vo都為恒定值 ， Ve值 是隨著分離物 分子質(zhì)量 的變化而 變化的 。 ? 分配系數(shù) Kav 用 分配系數(shù) Kav表示 被排阻的程度 ；即 ： 分離化合物 分配 在 內(nèi)水 和 外水體積 中的 比例 關(guān)系 。 ? 排阻 、 擴(kuò)散效應(yīng) （ 見下圖 ） 這種基質(zhì)可以 完全 或者 部分 排阻 某些大分子化合物 于篩孔之外 ， 而 不能排阻 某些 小分子 化合物 ， 但可讓其在 篩孔 中自由地 擴(kuò)散 、 滲透 。 缺點(diǎn)是對(duì)蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附能力 。 ? 玻璃珠 有大量的網(wǎng)孔 ， 且分布均一 。 ? 在用其分離樣品過程中 ， 溶液的酸堿度可在 pH3~12范圍內(nèi)變化 ， 溶液中加入去污劑 (如 1％ SDS)和 (或 )解離劑(如 8mol／ L尿素 、 6mol／ L鹽酸胍 )時(shí) ， 也不會(huì)影響分離效果 。 ? 層析時(shí) ， 用 細(xì)顆粒凝膠 分辨率高 五 、 Superdex ? Superdex是由高交聯(lián)度多孔 瓊脂糖 與 葡聚糖 共價(jià) 結(jié)合而成的 。 ? 用 去污劑 (如 SDS)、 6mol／ L鹽酸 胍和 8mol／ L尿素溶液可 作為洗脫劑 ， ? 高溫 (120℃ )消毒 ( )處理后 ， 層析性質(zhì)沒有明顯變化 。 ? 若在 有機(jī)相系統(tǒng) 使用時(shí)，其 孔徑 大小略有變化。 ? Sephacryl吸水時(shí)，其珠狀顆粒直徑為 2575um(見表 65)。 四 、 Sephacryl ? Sephacryl是由 烯丙烷基葡聚糖 與 甲撐雙丙烯酰胺 共價(jià)交聯(lián) 制成的 。 ? 聚丙烯酰胺凝膠對(duì) 芳香族的 、 酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象 ， 如使用 離子強(qiáng)度略高 的洗脫液操作 ， 此弊病可以克服 。 ? 一般聚丙烯酰胺凝膠均制成 珠狀顆粒 ， 并以 干 凝膠 形式出售 ， 使用前必須 溶脹 。 ? 當(dāng)改變單體濃度時(shí)，就可得到吸水率不同的產(chǎn)物。 三 、 聚丙烯酰胺凝膠 ? 聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為 Biogel。 正如前章所述 ， 用瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析時(shí) ，流速可以快些 。 ? CL型交聯(lián)瓊脂糖可在 廣范圍的 pH溶液 (pH3~1
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