親和色譜ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-05-11 22:19本頁(yè)面
【正文】 在堿性條件下 ， 其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián) 。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn) 配體脫落 現(xiàn)象。 溴化氰活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過(guò)程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨 (NH2)反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì)，洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法。雖然這種親和作用的機(jī)理尚不十分清楚，但利用固定化組氨酸吸附蛋白質(zhì)以及吸附蛋白的洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結(jié)合。 （ 7）組氨酸 在各種氨基酸中，組氨酸的性質(zhì)比較獨(dú)特：具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。 （ 6）過(guò)渡金屬離子 Cu2+、 Ni2+、 Zn2+、 Co2+等過(guò)渡金屬離子可與 N、 S和 O等供電原子（ electron donor atom）產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸（ His）的咪唑基、半胱氨酸（ Cys）的巰基和色氨酸（ Trp）的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用，其中以 His的咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng)。這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。 （ 5）輔酶和磷酸酰苷 各種脫氫酶和激酶需要在輔酶（ coenzyme）的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用。 （ 4）凝集素 凝集素 (lectin)是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（酶和抗體除外）的總稱(chēng)，大部分凝集素為多聚體，含有兩個(gè)以上的糖結(jié)合部位，不同的凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。 （ 3） A蛋白 A蛋白（ protein A）為分子量約 42KD的蛋白質(zhì)，存在于黃色葡萄球菌（ Staphylococcusaureus）的細(xì)胞壁中，占該細(xì)胞壁構(gòu)成成分約 5％。 抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)一般為 107～ 1012L/mol。酶的抑制劑在分子大小和形態(tài)上分布較廣，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。 親和吸附介質(zhì)的配基 （ 1）酶的抑制劑 一些物質(zhì)，它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上的某些必需基團(tuán)（主要是指酶活性中心上的一些基團(tuán)）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應(yīng)速度降低，能引起這類(lèi)抑制作用的物質(zhì)稱(chēng)為 酶的抑制劑（ inhibitor）。 24 配基分子的大小 ? 選用大分子配基。 ? 腺嘌呤 N6氨基接到載體上 ， 對(duì)脫氫酶和甘油激酶有吸附力 。 ? 理想的配基濃度為 110μmol/L。 ? 增加親和柱的長(zhǎng)度來(lái)提高吸附率 。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，所以在實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。 通用性配體 一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類(lèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（ lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合 RNA、結(jié)合 RNA的蛋白質(zhì)等。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。 親和色譜介質(zhì)的制備 配基的選擇 根據(jù)配體對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類(lèi)： 特異性配體（ specific ligand）和通用性配體（ general ligand）。 5．適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴? 3．較好的理化穩(wěn)定性。 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求： 1．極低的非特異性吸附。 親和色譜 ? 親和層析 (Affinity Chromatography， AC)是利用生物大分子具有對(duì)一類(lèi)生物大分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起
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