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生物工程設(shè)備第七章動物細(xì)胞生物反應(yīng)器-文庫吧資料

2024-11-08 09:50本頁面
  

【正文】 鈣鹽、鈉鐵鹽等要單獨配制保存,使用時再稀釋混合。對于吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2, 4二氯苯氧基 乙酸和萘乙酸這樣難溶于水的生長激素類物質(zhì),配溶液時可先溶于 95%的酒精中,然后慢慢加人蒸餾水,稍微加熱,稀釋至所需體積,再調(diào)節(jié) pH。生長激素在使用前需要重結(jié)晶提純,其酒精-水溶液要用吸附法脫色處理。 6.有機酸 在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時,加人丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等,能夠保證植物細(xì)胞生長,并且耐受鉀鹽的能力也有所提高。 5.有機氮源 通常采用的有機氮源 有水解酪蛋白 、谷氨酰 胺或氨基酸 混合物。 4.維生素 在各種維生素中,硫胺素(維生素 B2)可能是必需的,而煙酸和吡哆辛(維生素 B6)對生長有促進(jìn)作用。將分裂素和生長素一起使用,效果更佳。前兩種不穩(wěn)定,能被細(xì)胞釋放的酶降解,而后兩種被細(xì)胞降解的較慢,對熱穩(wěn)定。通常激素可分為二類:生長素和細(xì)胞分裂素。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量,可增加培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物量。培養(yǎng)基中蔗糖被迅速分解為葡萄糖和果糖,葡萄糖首先被利用,然后再利用果糖。 2.碳 源和能源 蔗糖或葡萄糖是常規(guī)的碳源,而果糖的利用效果較差。所需的鈉、磷和氯化物有鈣鹽、磷酸鹽和微量營養(yǎng)物提供。對常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來說,硝酸鹽加上銨的濃度可達(dá)到 60mmol/L,說明銨可能對某些培養(yǎng)物有重要作用。雖然硝酸鹽可以單獨作為無機氮源,但是加人一點銨鹽對細(xì)胞生長有利。 1.無 機鹽類 第 11 頁 共 22 頁 對于不同的培養(yǎng)對象和形式,無機鹽的最佳濃度是不相同的。植物細(xì)胞培養(yǎng)與動物細(xì)胞培養(yǎng)相比,其最大的優(yōu)點是植物細(xì)胞能在簡單的合成培養(yǎng)基上生長。具體培養(yǎng)方法將在下一節(jié)中介紹。 固定化細(xì)胞培 養(yǎng) 是在微生物和酶的固定化培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。與微生物培養(yǎng)相似,植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)也包括分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)(也叫流加培養(yǎng))、連續(xù)培養(yǎng)三種方式。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 是一種使組織培養(yǎng)物分離成單細(xì)胞并不斷擴增的液體培養(yǎng)技術(shù)。靜止培養(yǎng)無需任何設(shè)備,適合某些原生質(zhì)體的培養(yǎng)。培養(yǎng)基添加一定比例的瓊脂配制,用培養(yǎng)皿、三角燒瓶或試管分裝,經(jīng)高壓滅菌冷卻凝固后接種經(jīng)消毒過的外植體,整個過程需無菌操作。也可以將不同植物的原生質(zhì)體融合而獲得體細(xì)胞雜交的植株。 單倍體培養(yǎng) 一般是指花藥在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),從小孢子(雄性生殖細(xì)胞)直接發(fā)育成胚狀體,然后再長成單倍體植株;也可以通過愈傷組織誘導(dǎo)分化出芽和根,最終長成植株。隨著植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的逐步完善,單細(xì)胞培養(yǎng)的成功,各種新型生物反應(yīng)器的問世,利用植物 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成為大規(guī)模生產(chǎn)植物代謝產(chǎn)物的有效途徑。植物細(xì)胞生長緩慢、需氧低,此外,由于它們體積較大、細(xì)胞壁較厚、液泡較大而對剪切敏感。植物細(xì)胞含有人類所需的成分,而傳統(tǒng)的方法從植物中提取分離這些成分已很難滿足人們的需求。此反應(yīng)器已成功懸浮培養(yǎng)重組 NS0 細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體;懸浮培養(yǎng)人 293 細(xì)胞生產(chǎn)腺病毒(adenovirus);用昆蟲 sf9 細(xì)胞生產(chǎn)棒狀病毒 (baculovirus);用微載體 Cytodex3 培養(yǎng)人 393 細(xì)胞。裝置 簡單,易于操作,成本低,低剪切力,無空氣鼓泡,減低了氣泡對細(xì)胞的損害。培養(yǎng)細(xì)胞的密度可達(dá)到 7 106mL1 和 100L的工作體積 .使用前箱體用γ射線消毒,用后丟棄。廢氣通過一個消毒過濾器和止逆閥。箱中其余部分是空的,培養(yǎng)過程中空氣連續(xù)通過這里,空氣通過完整的過濾器進(jìn)入箱體。 國內(nèi)有人采用美國 NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC 公司生產(chǎn)的C elliG en P lus 堆積床生物反應(yīng)器,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分泌 rhEPO 的工程細(xì)胞株XP 9501,用于大規(guī)模生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。堆積床有以下特點:貼壁依賴性和懸浮細(xì)胞可成功地在堆積床內(nèi)附著;細(xì)胞不接觸氣液界面,低漩流 和低剪切力,細(xì)胞受到的傷害很??;反應(yīng)器能以分批式或連續(xù) /灌流方式運轉(zhuǎn),并可維持長時間 。通過調(diào)節(jié)氣體混合物的組成成分,完成對 pH 和 DO 的控制,加入氧氣或氮氣以滿足培養(yǎng)過程中氧氣的吸收;當(dāng) pH 太高時加入 CO2;空氣作為一種填充氣體,保持氣體進(jìn)入罐體時流速的穩(wěn)定。 1999 年,美國人 Zhaoliec 在攪拌式生物反應(yīng)器中利用重組 CHO 細(xì)胞 4B3 生產(chǎn)了纖維蛋白溶酶原激活 . (五)堆積床生物反應(yīng)器 (packedbed bioreactor) CelligenPlus 堆積床生物反應(yīng)器的工作原理為:當(dāng)推進(jìn)器 (impeller)旋轉(zhuǎn)時,培養(yǎng)基通過推進(jìn)器的中心空管螺旋式地從罐體底部往上流,然后 從 3 個出口中流出,通過堆積床向下流動至罐體底部,再通過推進(jìn)器的中心管往上流。它主要的優(yōu)點是能滿足高密度細(xì)胞培養(yǎng)的要求。旋轉(zhuǎn)濾器一般由不銹鋼絲網(wǎng)構(gòu)成,有良好的生物相溶性,易于清洗和消毒,可重復(fù)和長期使用。 (四)攪拌罐生物反應(yīng)器 (stirtank bioreactor) 第 9 頁 共 22 頁 攪拌罐生物反應(yīng)器基本結(jié)構(gòu)為:一個旋轉(zhuǎn)過濾器、一臺用于控制溫度、 pH 值、攪拌速度和溶氧 (DO)的數(shù)字控制裝置 (DCU)和起通氣作用的底部環(huán)形噴氣結(jié)構(gòu)。流化床反應(yīng)器可用于貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。這種反應(yīng)器的傳質(zhì)性能好,并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器,能快速提供給高密度細(xì)胞所需要的氧,同時排出代謝產(chǎn)物;反應(yīng)器中的液體流速足以使細(xì)胞微粒懸浮卻不損壞脆弱的細(xì)胞。 第 8 頁 共 22 頁 營養(yǎng)液不銹鋼微濾孔板中空纖維板反應(yīng)器主體培養(yǎng)液出口圖6 32 板框式中空纖維生物反應(yīng)器 營養(yǎng)液中空纖維管中央分配管反應(yīng)器主體排液口圖633 中心灌流式中空纖維生物反應(yīng)器 (三)流化床生物反應(yīng)器 (fluidizbed bioreactor) 流化床生物反應(yīng)器的 基本原理是培養(yǎng)液通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動,不斷提供給細(xì)胞必要的營養(yǎng)成分,使細(xì)胞得以在呈流態(tài)化的微粒中生長。該反應(yīng)器可用于為大規(guī)模中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)預(yù)測不同介質(zhì)、培養(yǎng)條件及其他因素對細(xì)胞生長可能產(chǎn)生的 。該反應(yīng)器可控制溶氧、介質(zhì)組成、溫度和 PH值,適合于細(xì)胞的高密度懸浮培養(yǎng),尤其適合于動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 ,由氧滲透膜管和中空纖維束構(gòu)成內(nèi)外空間,供細(xì)胞生長和向細(xì)胞提供營養(yǎng)。用泵控制培養(yǎng)介質(zhì)在反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)。細(xì)胞在中空纖維膜的一側(cè)生長,培養(yǎng)介質(zhì)在膜的另一側(cè)通過擴散向細(xì)胞傳遞營養(yǎng)。 Guinn發(fā)明了一個可用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)裝置,由中空纖維反應(yīng)器和灌流系統(tǒng)組成??諝夂?CO2的混合氣體在中空纖維間與培養(yǎng)液成錯流流過床層,向細(xì)胞提供氧分并維持一定的 PH值環(huán)境,細(xì)胞的代射物隨氣流帶出。該反應(yīng)器內(nèi)有一個垂直的中央分配管,外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個環(huán)狀床層。雖然一定程度上克服了柱狀中空纖維反應(yīng)器的不足,但是因為中空纖維淺床厚度有限,因而培養(yǎng)系統(tǒng)也不可能太大。由此,人們開發(fā)出板框式中空纖維反應(yīng)器。整個反應(yīng)器系統(tǒng)采用計算機監(jiān)控各種生長參數(shù),諸如營養(yǎng)鹽供應(yīng)、廢物排出、 pH、 DO、T等。克瑞克(Knazek) 20 世紀(jì) 70 年代初設(shè)計的。主要用于雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。 中空纖維管細(xì)胞培養(yǎng)裝置的產(chǎn)率與細(xì)胞分泌速度有關(guān)外,還與細(xì)胞培養(yǎng)裝置的設(shè)計有關(guān)。反第 7 頁 共 22 頁 應(yīng)器結(jié)構(gòu)如圖 63 633 所示。 (二)中空纖維管生物反應(yīng)器 (hollowfiber bioreactor) 中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微孔中空纖維管束組成的,纖維束由外殼包裹,因此可分為殼體空間及管體空間兩部分,每部分各有其進(jìn)出口。香港大學(xué)的Wen等人報道了一個新型的灌流裝置,由氣升式反應(yīng)器和澄清器組成,用于高密度培養(yǎng)動物細(xì)胞。 戴曉萍等人在氣升式反應(yīng)器中利用微載體培養(yǎng)技術(shù),研究了 Vero細(xì)胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。目前,我國利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)了大量生物制劑,多采用的是氣升式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器 大致有:氣升式生物反應(yīng)器,中空纖維管生物反應(yīng)器,流化床生物反應(yīng)器,攪拌罐生物反應(yīng)器,堆積床生物反應(yīng)器,一次性生物反應(yīng)器,膜生物反應(yīng)器等 。 除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外,用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計原則應(yīng)該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長環(huán)境。 70年代以來,細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器用很大的發(fā)展,種類越來越多,規(guī)模越來越大, 但是反應(yīng)器的主要結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式和固定床為主。動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)需要特殊的反應(yīng)器,與微生物和植物細(xì)胞不同,動物細(xì)胞外層沒有細(xì)胞壁,質(zhì)膜脆性大,對剪切敏感以及對體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴(yán)格的要求。 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器是整個過程的關(guān)鍵設(shè)備,它要為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量。高表達(dá)有工業(yè)價值蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞近年來亦更多地用微囊化培養(yǎng)。據(jù)報道,微囊中單抗?jié)舛群芨?,可達(dá) ,且無其它雜蛋白,容易獲得高純度單抗。最后用檸檬酸溶液處理,使細(xì)胞 得以懸浮在微囊中。將動物細(xì)胞和海藻酸溶液混合懸浮,經(jīng)微囊發(fā)生器制成微球滴入氯化鈣溶液中,制成凝膠球。 1987 年,利姆( Lim)和薩姆( Sum)制成了細(xì)胞能在其生長繁殖的微囊。在培養(yǎng)過程中,微囊化也能提供很高的細(xì)胞密度,產(chǎn)物濃度和細(xì)胞純度都有所增加。微囊化技術(shù)是用固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊里,在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。另外,由聚乙烯和二氧化硅制成的微載體 Cytoline,則適用于貼壁依賴性及非貼壁依賴性細(xì)胞的流化床或灌注培養(yǎng)。 Zhaolie C 等用多孔微載 體 Cytopore 培養(yǎng)重組 CHO 細(xì)胞系 4B3,最高細(xì)胞密度達(dá)到 106/ml[11]。 大多孔微載體以纖維素為基質(zhì),內(nèi)部有許多網(wǎng)狀的相互連通的小孔通向載體表面,細(xì)胞在接種后,易于進(jìn)入微載體內(nèi)部生長分裂,以避免剪切力或氣泡的影響,即使大部分細(xì)胞免受機械損傷,又為細(xì)胞提供了充分的生長空間。 1986 年, Nssina 報道了明膠大孔微載 體的制備及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。這類技術(shù)能維持很高的細(xì)胞密度,但很難達(dá)到 2L以上的規(guī)模。 但是,實心微載體的比表面積還是太小,于是人們設(shè)計了用微載體內(nèi)部固定細(xì)胞。近年來,國外新開發(fā)的 MC 主要有液體微載體、大孔纖維素微載體、 PHEMA 微載體、聚苯乙烯孔微載體 、聚氨酯泡沫微載體、磁性微載體。目前,狂犬病毒精制滅活疫苗就是采用 Cytodex 培養(yǎng) Vero 細(xì)胞而進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的。而且細(xì)胞與培養(yǎng)液的分離簡單,一旦攪拌停止, 3 分鐘后細(xì)胞即能依靠其重力而沉淀,只要去除上清液,而無須進(jìn)行離心操作。如將這種微載體在流化床式、固定床式反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),則可獲得比原來多 20~ 50 倍的高密度細(xì) 胞。微載體培養(yǎng)是細(xì)胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長,通過輕輕攪拌使細(xì)胞維持懸浮狀態(tài)。 1967 年,凡?維茨兒( Van Wezel)開發(fā)了微載體培養(yǎng)系統(tǒng) (Microcarrier, MC)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。 2.微載體培養(yǎng)技術(shù) 大多數(shù)動物細(xì)胞,都具有貼壁生長的特性,而傳統(tǒng)的適于貼壁生長的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),由于表面積的限制,很難達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的目的。此時細(xì)胞不在增殖,但可繼續(xù)分泌產(chǎn)物,分泌物的純度可達(dá) 60%90%。細(xì)胞向三維空間繁殖,形成類似組織的多層細(xì)胞群體,細(xì) 胞密度可達(dá) 109 個 /ml。與前面介紹的細(xì)胞生長在二維空間的培養(yǎng)技術(shù)不同,中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)。中空纖維是由聚楓或丙烯的聚合物組成的半透膜,水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過,細(xì)胞能在表面生長。 1.中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)法 1972 年,里查德 (六)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)始于 20 世紀(jì) 60 年代初 Capstick 及其同事為生產(chǎn) FDM 疫苗而對 BHK 細(xì)胞的研究。懸浮培養(yǎng)設(shè)備要求簡單、細(xì)胞增殖快,可借鑒微生物發(fā)酵的成功經(jīng)驗。傳 代時不需再分散,只需按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。 2.懸浮培養(yǎng)技術(shù) 少數(shù)非貼壁生長型細(xì)胞,如雜交瘤細(xì)胞,能在培養(yǎng)器中自由懸浮生長。 貼壁培養(yǎng)的一般步驟是,先將組織塊消化,使之分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞狀態(tài),經(jīng)過濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜營養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。貼壁培養(yǎng)的表面要求有帶有適量的正電荷和高度的表面活性,主要材料有明礬—— 硅硼酸玻璃、聚苯乙烯、不銹鋼等。當(dāng)細(xì)胞生長到表面相互接觸時,就停止分裂增殖,這種現(xiàn)象稱為接觸抑制( contact inhibition)。 (五)動物細(xì)胞常用的培養(yǎng)方法 1.貼壁培養(yǎng)技術(shù) 大多數(shù)細(xì)胞在離體培養(yǎng)的條件下,都要附著在固體表面上才能生長。 ③制霉菌素液:因其不溶 于水,將其制成 5, 000181。使用時在 100mL 培養(yǎng)基中加入 母液,則最終濃度為 50181。 ②卡那霉素液:取 5 萬微克卡那霉素溶于 50mLHanks 液中,即成 10, 000181。使用時在 100mL 培養(yǎng)基中加入 母液,則最終濃度為每毫升含 100 單位青霉素、 100181。 ( 3)抗生素液 細(xì)胞培養(yǎng) 的過程中,需向培養(yǎng)液中加入適量的抗生素液,以防止微生物的污染,而不影響
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