【正文】 家蠶Yellow蛋白家族基因的組織表達(dá)譜。我們通過(guò)果蠅Yellow基因序列進(jìn)行blast比對(duì)分析獲得家蠶Yellow基因的EST序列，然后通過(guò)RACE法得到家蠶Yellow蛋白家族成員全長(zhǎng)cDNA序列，該蛋白家族包含存在MRJP域和信號(hào)肽的7個(gè)成員。（b）家蠶Yellow基因家族的鑒定和分析研究表明，Yellow蛋白家族在蜜蜂和果蠅的發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)重要的生理和生化功能，該蛋白家族成員都包含一個(gè)MRJP保守域。通過(guò)蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)的功能分析，發(fā)現(xiàn)一些重要相關(guān)蛋白質(zhì)，涉及了細(xì)胞骨架蛋白，HSP蛋白家族以及與細(xì)胞周期，凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)蛋白質(zhì)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能通過(guò)不同途徑參與了家蠶孤雌生殖的發(fā)育過(guò)程并發(fā)揮著不同的功能。我們采取上述開(kāi)發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段分析了家蠶有性和孤雌生殖蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高溫激變方法可獲取較滿(mǎn)意的無(wú)性繁殖發(fā)育卵和孵殖率；并且高溫刺激方法獲得的孵化率在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨著卵齡的增加孵化率有所提高。我們進(jìn)行了家蠶有性生殖和孤雌生殖的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。采用該制備方法獲得了據(jù)我們所知迄今為止分離蠶卵樣品最多點(diǎn)的蛋白質(zhì)組圖譜，這將有利于更多生物相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)以及鑒定，為構(gòu)建較完善的蠶卵蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究工作成功建立的一種蠶卵蛋白質(zhì)制備的新方法，通過(guò)采取獨(dú)特的預(yù)分離策略有效減少了蠶卵樣品中高豐度蛋白質(zhì)含量，從而提高了低豐度蛋白質(zhì)的上樣量。樣品的制備無(wú)疑是蛋白質(zhì)組學(xué)2DE電泳分離最為重要和關(guān)鍵的一步。為了獲得更多的家蠶卵蛋白，我們開(kāi)發(fā)了一種新的家蠶卵蛋白樣品制備方法。12）；同時(shí)，八孔道加樣器使用簡(jiǎn)單和可確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法電泳結(jié)果較常規(guī)的水化上樣有明顯的改善（952177。我們改進(jìn)的上樣方式通過(guò)采用八孔道加樣器，先將水化液轉(zhuǎn)移到膠條槽內(nèi)，再將樣品以均勻滴加的方式分布在水化液滴上，在重漲膠條過(guò)程中施加電壓。現(xiàn)有的2DE的上樣方式主要有水化上樣（混合上樣）和杯上樣兩種。該上樣方式改進(jìn)了傳統(tǒng)的上樣技術(shù)，采用八孔道加樣器和獨(dú)特的上樣程序減小了蛋白樣品的損失。相關(guān)研究成果發(fā)表在Comp. Biochem. 。提取五齡蠶的各個(gè)組織和各個(gè)時(shí)期（卵，幼蟲(chóng)，蛹，蛾）的總RNA，進(jìn)一步用熒光相對(duì)定量PCR檢測(cè)表明BmSPI在表皮中表達(dá)量最高，脂肪體中表達(dá)量最低，在幼蟲(chóng)期中表達(dá)量最高，在卵期表達(dá)量最低。將爬片的Bm5細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BmSPI表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞核中幾乎沒(méi)有。（g）家蠶中一個(gè)新Kazal型蛋白酶抑制劑的表達(dá)、定位及其功能研究Kazal型蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內(nèi)，對(duì)機(jī)體的發(fā)育和免疫應(yīng)答等生理過(guò)程發(fā)揮極其重要的作用。DNA Ladder實(shí)驗(yàn)表明，干擾后死細(xì)胞數(shù)量增加，但細(xì)胞并未發(fā)生正常的凋亡現(xiàn)象，推測(cè)是干擾后一些非正常因素導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。我們還合成了BmRNAMTase的dsRNA，并轉(zhuǎn)染了家蠶細(xì)胞Bm5，通過(guò)MTT法測(cè)細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， μg/ml、干擾72h后細(xì)胞活性明顯降低。Western印跡分析呈陽(yáng)性并發(fā)現(xiàn)在蠶蛹中也有特異性條帶，分子量為20kD左右，證實(shí)了重組蛋白的表達(dá)。RNA中的這些甲基化修飾主要是通過(guò)SadenosylLmethionone（AdoMet）依賴(lài)的甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)來(lái)催化的。相關(guān)研究成果發(fā)表在A(yíng)ppl. Biochem. 。熒光定量PCR結(jié)果顯示BmPFN蛋白在各組織中絲腺表達(dá)量最高，生殖器表達(dá)量次之，脂肪體中的表達(dá)量最低；在卵、幼蟲(chóng)、蛹和蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期中，幼蟲(chóng)的表達(dá)量最高，蛹次之，蛾中較少，卵中表達(dá)量最少；同時(shí)Western blotting結(jié)果顯示BmPFN在蛹期表達(dá)最高，mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平存在一定的差異，該蛋白可能存在翻譯水平的調(diào)控，如microRNA對(duì)蛋白表達(dá)調(diào)控，生物信息學(xué)分析也表明該基因mRNA存在9個(gè)microRNA結(jié)合位點(diǎn)，正在進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。我們獲得并表達(dá)了家蠶profilin基因BmPFN，制備的多克隆抗體效價(jià)為1:32000。相關(guān)研究成果發(fā)表在Cell Tissue 。我們還利用熒光定量PCR的方法，對(duì)家蠶卵、五齡幼蟲(chóng)、蛹、蛾等發(fā)育時(shí)期，以及五齡幼蟲(chóng)各組織中的靶mRNA的量進(jìn)行比較。通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們也發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在家蠶五齡幼蟲(chóng)的表皮、氣門(mén)、腸道、馬氏管、頭部等組織中，以及蛹的頭部、腸道、體壁等組織中。我們獲得并表達(dá)了家蠶TnC基因，制備的相應(yīng)抗體效價(jià)可達(dá)到1：25600以上。（d）家蠶肌鈣蛋白C基因的研究肌鈣蛋白C（Troponin C, TnC）是一種EF手圖形超家族蛋白，可以結(jié)合Ca2+并發(fā)揮其生物學(xué)功能。我們同時(shí)研究了Bm1433ζ在蛹、絲腺、頭部、脂肪體以及腸中的結(jié)合蛋白，電泳分析發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)組織中可與Bm1433ζ蛋白結(jié)合的蛋白至少有4個(gè)組分，這些組分的大小主要位于28~54 kDa之間，Bm1433ζ在各組織的結(jié)合蛋白大小非常相似，這說(shuō)明Bm1433ζ在細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。通過(guò)Western blotting和免疫熒光法分析了兩種1433蛋白的亞細(xì)胞定位，Bm1433ζ蛋白既存在于細(xì)胞質(zhì)中也存在細(xì)胞核中，而B(niǎo)m1433ε蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中。（c）兩種家蠶1433蛋白的表達(dá)分析及其亞細(xì)胞定位通過(guò)家蠶蛹cDNA文庫(kù)的構(gòu)建獲得家蠶1433ε和1433ζ基因,我們表達(dá)并制備了該基因的多克隆抗體。這些數(shù)據(jù)表明，在家蠶中維甲酸結(jié)合蛋白的主要功能是影響atRA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。隨后用pEGFPC1CRABP和dsRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，MTT試驗(yàn)表明，當(dāng)Bm5細(xì)胞過(guò)量表達(dá)CRABP時(shí)，用atRA處理后，細(xì)胞對(duì)atRA誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制產(chǎn)生耐受性；當(dāng)CRABP的表達(dá)被干擾而降低時(shí)，細(xì)胞對(duì)atRA引起的生長(zhǎng)抑制作用更加敏感。我們用不同量的dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，atRA處理后用MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力，以此確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。生物信息學(xué)分析推測(cè)BmCRABP可能與RA的降解有關(guān)，因此我們研究了BmCRABP和全反式維甲酸(alltrans retinoic acid, atRA)的關(guān)系。維甲酸是一種重要的信號(hào)分子，能通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。相關(guān)研究成果發(fā)表在A(yíng)ppl. Biochem. 。通過(guò)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，我們發(fā)現(xiàn)大量蛹期表達(dá)的功能基因，對(duì)其中部分功能基因進(jìn)行了表達(dá)，抗體制備和功能研究，為進(jìn)一步研究這些功能基因在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)。我們利用BmBacPAKph表達(dá)膜蛋白，膜蛋白與多角體蛋白融合形成結(jié)晶，表達(dá)量達(dá)到14mg/蛹（2g）(如圖1所示)。這種新的表達(dá)系統(tǒng)可獲得更多的重組目的蛋白，因?yàn)槎嘟求w蛋白基因序列保留越多，則表達(dá)水平越接近天然多角體蛋白的表達(dá)水平（3050%），因而目的蛋白的表達(dá)量可超過(guò)5%。四、家蠶生物反應(yīng)器多角體結(jié)晶特征表達(dá)技術(shù)平臺(tái)體系構(gòu)建將多角體基因與目的基因融合，克隆到轉(zhuǎn)移載體中，再通過(guò)在家蠶細(xì)胞BmN中與線(xiàn)性化BmBacPAK6病毒發(fā)生同源重組得到多角體融合表達(dá)載體，其不僅恢復(fù)了必需基因ORF1629，救活了病毒，而且恢復(fù)了多角體基因?？梢赃_(dá)到同時(shí)把細(xì)胞的膜蛋白和囊泡等膜蛋白分離的目的，對(duì)推動(dòng)膜蛋白組學(xué)的研究增添了新的手段和技術(shù)。另外，可以通過(guò)特定細(xì)胞或組織培養(yǎng)的方式，獲得特定細(xì)胞或組織的細(xì)胞膜蛋白，對(duì)藥物開(kāi)發(fā)具有十分重要的意義?；诔鲅坎《静?biāo)記蛋白展示宿主細(xì)胞表面，通過(guò)病毒出芽，將宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜剝離于細(xì)胞而獲得純的膜結(jié)構(gòu)達(dá)到分離獲得膜蛋白的目的，特別適合分離低豐度膜蛋白。掃描電鏡證實(shí)破裂的帶有HA活性的膜成分以囊球狀存在。在重組病毒感染細(xì)胞后期112小時(shí)，細(xì)胞膜由于病毒大量出芽而破碎，但破碎的膜上仍帶有大量的HA融合蛋白。經(jīng)過(guò)2D電泳分離后，進(jìn)行酶解，質(zhì)譜分析，目標(biāo)蛋白中80%以上為膜蛋白。此重組病毒感染家蠶蛹體72小時(shí)，獲得融合蛋白可展示于囊膜病毒囊膜表面的重組病毒。三、基于桿狀病毒出芽方式的全新膜蛋白分離技術(shù)平臺(tái)體系的構(gòu)建桿狀病毒在細(xì)胞的感染初期以出芽病毒的方式穿過(guò)細(xì)胞膜并帶走細(xì)胞膜以囊膜病毒的形式存在。目前疫苗I期臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展中。結(jié)果顯示：禽流感疫苗對(duì)豚鼠過(guò)敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽(yáng)性，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。（f）禽流感疫苗豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)資料健康白色豚鼠分別皮下注射禽流感疫苗 1700μg、340μg/()，牛血清白蛋白生理鹽水溶液60mg（2ml）/（）和溶媒2ml/（）劑量，隔日一次，連續(xù)3次進(jìn)行致敏。中毒劑量未明顯顯示。（e）禽流感疫苗大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)SD大鼠連續(xù)八次皮下注射給予批號(hào)為200610020061201的禽流感疫苗，對(duì)大鼠的主要毒副反應(yīng)為注射部位出現(xiàn)肉芽腫樣結(jié)節(jié)但停藥有逐漸縮小的趨勢(shì)，個(gè)別血液學(xué)指標(biāo)（Grn↑，MCV↓）和臟器的重量及系數(shù)（肝臟系數(shù)、脾臟重量及系數(shù)↑）的升降影響。 mg/kg。次）、%NaCl注射液 1 ml/（kg對(duì)大鼠、小鼠皮下注射的最大耐受劑量分別為：大鼠 94mg/kg（相當(dāng)于人臨床擬用劑量的18800倍、大鼠有效劑量的250倍）；小鼠 141mg/kg（相當(dāng)于人臨床擬用劑量的28200倍、小鼠等效劑量的263倍）。對(duì)猴心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和體溫也無(wú)明顯影響。（b）禽流感疫苗對(duì)心血管、呼吸系統(tǒng)及體溫的影響猴心血管及呼吸系統(tǒng)試驗(yàn)表明：、對(duì)猴心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯影響，其血壓、呼吸頻率、呼吸幅度和心電各指標(biāo)均與給藥前相似（P）；對(duì)猴體溫也無(wú)明顯影響，其各測(cè)量時(shí)間段的平均體溫與給藥前相似（P），也與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組相似（P）。試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗組的高、中劑量組有抵御病毒攻擊的作用。病毒接種后第7天，低劑量組和模型對(duì)照組各有1只動(dòng)物的肺組織中分離出病毒。攻毒后第2天高、中、低劑量組分別有1只動(dòng)物中和抗體達(dá)到1：4，攻毒后第5天高、低劑量組各有1只動(dòng)物中和抗體達(dá)到1：4，攻毒后第7天高、中、低劑量組分別有1只動(dòng)物中和抗體達(dá)到1：8，攻毒后第14天高、中、低劑量組分別有1只動(dòng)物中和抗體達(dá)到1：16。免疫及攻毒后，各組試驗(yàn)動(dòng)物的血生化、血常規(guī)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。病毒分離、RTPCR結(jié)果顯示重組疫苗可能有抵御病毒攻擊的作用。(3) 重組人用禽流感疫苗臨床前的有效性評(píng)價(jià)每組14只的BALB/C小鼠按高中低劑量組分別以150μg/kg體重，30μg/kg體重，6μg/kg體重免疫總體積1ml的禽流感疫苗，免疫3次，每次間隔2周，抗體效價(jià)達(dá)到最高峰時(shí)攻毒，觀(guān)察疫苗的免疫保護(hù)效果。將重組桿狀病毒接種蠶蛹后56天收獲蠶蛹，經(jīng)過(guò)多步離心、超速離心、區(qū)帶離心、超濾等方法收獲重組桿狀病毒。人工合成含有桿狀病毒gp64信號(hào)肽、跨膜區(qū)與A/Zhejiang/16/06(H5N1)毒株的HA基因的融合基因，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAKgp64HA，與線(xiàn)性化的野生型桿狀病毒BacPAK6共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多輪篩選，獲得表達(dá)HA蛋白的重組桿狀病毒Bmgp64HA。同時(shí)，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學(xué)活性。二、家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)平臺(tái)體系的構(gòu)建與安全有效的人用禽流感疫苗的快速制備(1) 家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)平臺(tái)體系的建立家蠶桿狀病毒gp64蛋白N端為信號(hào)肽序列，近C端為跨膜結(jié)構(gòu)域，外源蛋白在信號(hào)肽的C 端與跨膜結(jié)構(gòu)域N 端之間發(fā)生融合，融合蛋白經(jīng)過(guò)真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工后，信號(hào)肽被切除，形成的N端融合蛋白可穩(wěn)定地展示于桿狀病毒的表面，形成刺猬狀“偽病毒”。（vii）蠶表達(dá)丙肝抗原制備治療和抗丙型肝炎口服藥物的研究用蠶表達(dá)的丙型肝炎（HCV）的C+E1基因產(chǎn)物，可以應(yīng)用HCV抗體的檢測(cè)，用蠶表達(dá)的HCV的C+E1基因產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)劑型研制，進(jìn)行動(dòng)物口服試驗(yàn)，通過(guò)三百只老鼠的試驗(yàn)，口服組的HCV抗體陽(yáng)性率超過(guò)到95%以上，為口服疫苗的研制提供依據(jù)。通過(guò)低溫冷凍干燥及劑型的研制，研制了rhEPO膠囊(康血寶)。相關(guān)研究成果發(fā)表在A(yíng)frican J. 。動(dòng)物試驗(yàn)表明，感染重組病毒和野生病毒的家蠶蛹都能保護(hù)小鼠胃粘膜防止酒精誘導(dǎo)的胃損害。ELISA 檢測(cè)表明在家蠶幼蟲(chóng)和蛹中，感染重組病毒后第四天hEGF蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。相關(guān)研究成果發(fā)表在A(yíng)vian Biochim. Biophys. 。相關(guān)研究成果發(fā)表在A(yíng)cta Biochim. . 。以上結(jié)果表明，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的OPG具有潛在預(yù)防和治療高血鈣、骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的功能。雖然劑量要求比注射方式要重些，但從時(shí)間來(lái)看，效果比后者持續(xù)的更久些。通過(guò)灌胃的方式，對(duì)小鼠進(jìn)行了降血鈣和骨保護(hù)的口服研究。對(duì)小鼠每天腹腔注射一次含重組蛋白的蠶血淋巴。（iii）家蠶表達(dá)人破骨細(xì)胞形成抑制因子生產(chǎn)口服治療高血鈣、骨質(zhì)疏松癥藥物的研究我們獲得了在家蠶中能高效表達(dá)破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG及變體OPG372的重組桿狀病毒病毒，并發(fā)現(xiàn)rhOPG在家蠶幼蟲(chóng)的表達(dá)產(chǎn)物還有二聚體的形式。結(jié)果表明利用重組hLf治療潰瘍性結(jié)腸炎，反映臨床表現(xiàn)的DAI和組織學(xué)得到改善，髓過(guò)氧化物酶（MPO）明顯降低，有效的緩解硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性急性結(jié)腸炎，為進(jìn)一步進(jìn)入臨床，生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物打下理論基礎(chǔ)。采取灌喂法，連續(xù)給藥10天后，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。（ii）家蠶表達(dá)人乳鐵蛋白生產(chǎn)口服治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物研究我們獲得了在蠶體中能高效表達(dá)人乳鐵蛋白（hLf）基因的重組家蠶桿狀病毒，在家蠶中表達(dá)量高達(dá)192 μg/ml蠶血淋巴。在將表達(dá)的幾種SARS基因疫苗注入實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)后，成功地在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)檢測(cè)到了非典（抗SARS病毒）抗體，而非接種組均無(wú)抗體反應(yīng)。(4) 家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)其他口服藥物和疫苗的研究我們同時(shí)還開(kāi)展了其他許多重要藥用蛋白和疫苗的表達(dá)和口服研究工作。本研究表明口服家蠶表達(dá)的CTB與人胰島素B鏈融合蛋白可以作為一種口服蛋白疫苗，并對(duì)NOD模型鼠的胰島炎癥具有很好的抑制作用。非肥胖性糖尿病小鼠經(jīng)口服含微克級(jí)的CTB與胰島素B鏈融合蛋白的蠶血淋巴，病理組織切片實(shí)驗(yàn)表明小鼠胰島發(fā)炎程度顯著減輕。胰島素B鏈包含了胰島素的主要抗原決定族，僅僅口服胰島素B鏈在動(dòng)物模型中同樣能抑制糖尿病的發(fā)生，其效果與口服胰島素完整蛋白相近。相關(guān)研究成果發(fā)表在Biotech.