【正文】 滾瓶系統，雖然能增加細胞生長的貼壁面積，但所占的空間大，勞動強度大、細胞產率低、不易監(jiān)控等缺點限制了他的進一步發(fā) 展。經過幾十年的研究，微載體培養(yǎng)已廣泛地應用于動物細胞的培養(yǎng)，其中尤以Pharmacia 生物技術公司生產的微載體 (Cytodex、 Cytopore、 Cytoline 等 )使用范圍最廣。這種培養(yǎng)較傳統的單層細胞培養(yǎng)，面積大大增加。另外，這種培養(yǎng)的勞動強度減少， 1 升微載體培養(yǎng)生產的細胞相當于 50 個轉瓶 (490cm2/瓶 )所生產的細胞，省卻了玻璃容器等的清洗和準備工作。減少了繁復的操作步驟，降低了污染率。 常用的微珠載體是 DEAE交聯葡聚糖微粒。其中磁性微載體是由鐵、鈷或鎳的磁性氧化物與經戊二醛處理的明膠混合、研磨，并用水解蛋白酶處理后制成，對疫苗、干擾素、生長素的生產均具有應用潛力，且產品質量較高。如海藻酸鈉系統、瓊脂糖系統、瓊脂糖 —— 海藻酸鈉系統等。 1985年， Verax公司開創(chuàng)了大孔微載體培養(yǎng)技術，接著有了 Percell系統和 Siran 系統。大孔微載體除了有利于細胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)外，在外源蛋白的長期高效表達方面也明顯的優(yōu)勢。 Onderwater 等報道，使用大多孔微載體培養(yǎng)能表達人類細胞色素Ｐ 450 同功酶的Ｖ 79 細胞，細胞量從接種時的 2 105/ml，增加到六天后的 1 107/ml。胡顯文等將 Cytopore 多孔微載體用于中試規(guī)模的反應器，也收到了很好的效果。 3．微囊化培養(yǎng)技術 微囊是一種由半透膜制成的多孔微球體，酶及大分子不能從微囊中溢出，而小分子物質可以通過。細胞第 6 頁 共 22 頁 微囊化后，由于生長在各自的微小環(huán)境里，減少了培養(yǎng)時攪拌 對細胞的剪切力，細胞生長良好，培養(yǎng)液易于迅速改變，且無分離細胞與培養(yǎng)液的困難。微囊化培養(yǎng)技術為單克隆抗體、干擾素、乙肝表面抗原等大規(guī)模生產提供了廣泛的應用前景。制備微囊化細胞所用的材料主要是海藻酸和多聚賴氨酸。然后用聚賴氨酸處理，使膠球表面包裹一層膜。得到的動物細胞微囊就可懸浮與培養(yǎng)基中培養(yǎng)。目前，微囊工藝已用于生產以克計的單克隆抗體。 二、動物細胞培養(yǎng)生物反應器 生物反應器是生化工藝過程中唯一一個把原料轉化為產物的地方。 因此，生物反應器的選擇對整個生物反應過程至關重要。因此，傳統的微生物發(fā)酵用的反應器不能用于動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，而 具備低的剪切效應、較好的傳遞效果和力學性質是這類反應器設計或改進所必須遵循的原則。在國外， Celltech公司建立了 10000L規(guī)模的生物反應器，培養(yǎng)雜交瘤細胞生產單克隆抗體； Sumitomo公司建立了 8000L攪拌反應器生產病毒疫苗、干擾素和其它生物制品，我國在“七五”期間已經開始這方面的研究，已成功地研制了 CellCul－ 20Ａ等細胞培養(yǎng)用生物反應器。由于動物細胞生長的特殊性，需要特別注意反應器結構設計以及特殊載體的選擇。 （一）氣升式生物反應器 （ airlift bioreactor） 氣升式生物反應器是實現動物細胞高密度培養(yǎng)的常用設備之一，其特點是結構簡單，操作方便。氣升式細胞培養(yǎng)生物反應器的原理及結構見本書第五章第二節(jié)。證明氣升式反應器中懸浮微載體培養(yǎng) Vero細胞，在加入適量保護劑、營養(yǎng)供應充足的情況下，細胞可以正常生長至長滿微載體表面，終密度可達 106個 /mL。在灌流循環(huán)中，細胞經過兩級沉降回到反應器，平均培養(yǎng)密度達到 107個 /mL。一般地說，細胞生長在殼體部分，新鮮培養(yǎng)液從殼體部分導人，氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地擴散至 殼體部分。殼體部分的細胞如是附壁性的，則附著在纖維外側，在培養(yǎng)結束后用胰蛋白酶消化液將其消化并沖出；若是非附壁性的，應采用微濾材料將其截留在殼體內而讓廢培養(yǎng)液排出 。 它 由于剪切力小而廣泛用于動物細胞的培養(yǎng) ，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞密度最高可達 109 cells/mL 數量級。 柱狀中空纖維反應器是最目前最常用的中空纖維反應器類型，是理查 德以Ｅ ndotronics 公司生產的最著名的 AcusystPM大規(guī)模生產系統為例，這種反應器的套管是一圓柱體，包含了兩條獨立的流動通道，每條通道連接有６個中型的中空纖維反應器。 因柱狀中空纖維反應器中營養(yǎng)供應和代謝產物會存在濃度梯度，所以細胞分布受到影響而不均勻，限制了培養(yǎng)系統的進一步放大。該反應器的中心是一束中空纖維淺床，置于兩個不銹 鋼微孔濾板之間，營養(yǎng)液通過濾板垂直流向纖維床乎面。 John等報道了一個用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的徑向流中空纖維反應器。培養(yǎng)液由中央分配管徑向流過中空纖維床，細胞在中空纖維外壁貼附并生長。在這個反應器中細胞生長 的表面密度可達 106個 /cm2。液體通過泵在反應系統內循環(huán)，灌流系統補充或置換培養(yǎng)介質及移出代謝物。該反應器能為細胞提供一個溫和的生長環(huán)境。培養(yǎng)液在中空纖維腔內流動并通過中空纖維膜向另一側供應細胞生長所需的養(yǎng)分。細胞培養(yǎng)密度幾乎能達到2 108個 /ml。 中空纖維管反應器總的發(fā)展趨勢是讓細胞在管束外空間中生長，用這種方式，能獲的更高密度的細胞。同時，不斷加入新鮮培養(yǎng)液。流化床生物反應器滿足了高密度細胞培養(yǎng)，使高產量細胞長時間停留在反應器中，優(yōu)化了細胞生長與產物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的要求。另外，流化床反應器放大也比較容易，放 大效應小，已成功地從 放大至 10L，用于培養(yǎng)同種細胞生產單克隆抗體，體積生產率基本一致?；驹硎切迈r培養(yǎng)基分散進入旋轉濾器的外部區(qū)域，從旋轉濾器的中間獲得無微載體的收集液。 在攪拌式生物反應器中同樣可以培 養(yǎng)懸浮生長的細胞，又能培養(yǎng)貼壁生長的細胞。 CelliGen 籠式通氣攪拌罐和 20L 雙層籠式通氣攪拌罐（ CellCul20）已經大規(guī)模培養(yǎng)多種細胞。細胞附著在堆積床的聚酯片上，氣體從噴射器噴出進入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基通過蠕動泵從培養(yǎng)基儲存瓶 (mediareservoir)中進入反應器，收集液通過蠕動泵從反應器中流出進入收集瓶。聚酯片提供高的表面積 /體積比率，維持高細胞密度。 （六）一次性生物反器 (disposable bioreactor) 這種生物反應器由預先消毒的、 FDA 認可的、對生物無害的聚乙烯塑料箱組成，箱中部分填充培養(yǎng)基 并接種細胞。前后搖動箱體使液氣界面產生波動，大大提高了氧氣的溶解量，有利于排出 CO2，控制 pH 值，也促使培養(yǎng)液混合均勻，細胞和顆粒不會下沉。整個生物反應器置于傳統的細胞培養(yǎng)用 CO2 培養(yǎng)箱中，便于控制溫度和 pH 值，或者在箱體底部加熱控制溫度。特殊的開孔可進行無菌加樣、取樣，而不必把生物反應器置于層流罩中。可用于培養(yǎng)動物細胞和植物細胞，并十分適合生產病毒。 第 10 頁 共 22 頁 植物細胞培養(yǎng)生物反應器 植物細胞培養(yǎng)是指在離體的條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞 增殖，從而獲得大量的細胞群體的一種技術。近年來，利用植物細胞培養(yǎng)來生產有用代謝產物已受到廣泛的關注，但是，只有一小部分的產品已成功用于商業(yè)化生產，其原因是反應器設計、過程發(fā)展以及對反應機理知識的欠缺等工藝上的限制。因此氣升式和柱狀生物反應器應用較為普遍。 一、植物細胞培養(yǎng)過程 植物細胞培養(yǎng)按照培養(yǎng)對象可分為單倍體細胞培養(yǎng)和原生質體培養(yǎng)；按照培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按照培養(yǎng)方式可分為懸浮培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。 原生質體培養(yǎng) 將植物的體細胞（二倍體細胞）經纖維素酶等去掉細胞壁處理后，獲得的原生質體（ protoplast）在無菌培養(yǎng)基上生長、分 裂，最終長成植株。 固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)的方法。 液體培養(yǎng) 也是在微生物培養(yǎng)基礎上發(fā)展起來的，可分為靜止與振蕩兩種。振蕩培養(yǎng)需要搖床或轉床等設備，可使培養(yǎng)物充分混合以利于氣體交換。在進行細胞培養(yǎng)時需要提供容易碎裂的愈傷組織進行液體培養(yǎng)。目前，植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)主要采用懸浮培養(yǎng)方式，這主要是由于懸浮培養(yǎng)可以增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，促進營養(yǎng)的吸收；可帶走培養(yǎng)物產生的有害代謝產物，避免高濃度積聚對細胞的傷害；可保證良好的混合狀態(tài)，從而獲得良好的氣體傳遞效果；可以借鑒發(fā)酵工程的成熟技術，容易放大實現規(guī)?；Ｊ枪腆w培養(yǎng)的一種，但不是使用固體培養(yǎng)基，而是與固定化酶或固定化微生物細胞培養(yǎng)類似的一種植物細胞培養(yǎng)技術，目前應用最廣泛的、能很好保持細胞活性的固定化方法是將細胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。 （一）植物細胞培養(yǎng)基 對植物細胞的生長而言，培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性的因素。其培養(yǎng)基主要由無機鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機氮源、有機酸等組成。通常在培養(yǎng)基中至少含有25mmol/L的硝酸鹽和鉀。如果銨鹽單獨作為氮源，添加一些琥珀酸或其他三羧酸循環(huán)酸效果更好。鎂、鈣和硫元素的濃度在ｌ～３ mmol／Ｌ范圍較為合適。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。其他糖類均不合適作為單一的碳源。大多數植物細胞對蔗糖的需求范圍是 2%到 4%。 3．植物生長激素 植物激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成部分，大多數植物細胞培養(yǎng)基中都含有天然的和合成的植物生長激素。生長素能促進細胞分裂，常用的有吲哚乙酸（ IAA）、吲哚丁酸（ IBA）、 2， 4二氯苯氧基乙酸 （ 2， 4Ｄ）和萘乙酸（ NAA）。細胞分裂素常用的是 6芐基瞟憐（ 6BA），激動素（ kt）和玉米素（ zeatin）。使用量在 ~10ｍｇ／Ｌ之間，可根據不同細胞株而異。一般在培養(yǎng)基中都加了較多的肌醇，它能促進愈傷組織的生長。 在 細胞初級培養(yǎng)的早期生長階段 ，有機氮源可促進胚胎發(fā)生和多胚性出現 。 （二）植物細胞培養(yǎng)基的制備 配制培養(yǎng)基所用的蒸餾水最好是用玻璃容器蒸餾過的去礦質鹽的蒸餾水，所用的無機鹽、碳源、維生素應該采用高純度級的藥品。蛋白水解液最好用酶水解。由于培養(yǎng)基配比中有些組分量很小，可按培養(yǎng)基配方濃度配成使用濃度的 10倍或者更多倍的母液，分成小瓶后冷凍保存，使用時再稀釋到正常濃度。維生素每種也是分開配制的。在培養(yǎng)基配制過程中可用 ，固體培養(yǎng)基加人瓊脂 %～％， 121℃蒸汽滅菌 15~20min。 二、植物細胞培養(yǎng)生物反應器 第 12 頁 共 22 頁 與天然栽培法相比，利用植物細胞培養(yǎng)技術生產藥用代謝產物、食品添加劑、化妝品等具有明顯的優(yōu)勢，但能成功地把搖瓶培養(yǎng)的結果放大到生物反應器中而實現大規(guī)模培養(yǎng)的較少，可見研究合適的生物反應器對于植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產有用代 謝產物是非常重要的。由于植物細胞與微生物細胞形態(tài)結構不同，植物細胞較微生物細胞大，對氧需求小，對剪切力卻很敏感，因此不象微生物培養(yǎng)那樣采用高剪切的攪拌，而混合顯得更重要。用于植物細胞培養(yǎng)的反應器主要有攪拌式、非攪拌式及其它新型生物反應器，另外還有植物細胞固定化反應器和膜反應器等。但是攪拌罐中產生的剪切力大，容易損傷細胞，且植物細胞培養(yǎng)一般只需較低的溶氧系數。為此，對攪拌罐進行了改進，包括改變攪拌形式、葉輪結構與類型、空氣分布器等，力求減少產生的剪切力，同時滿足供氧與混合的要求。Jolicoeur 等進行了類似的研 究，在反應器中得到與搖瓶相同的高濃度生物量。 離 心 式 葉 輪 反 應 器(centrifugalimpellerbioreactor)與細胞升式反應器 (cellliftbioreactor)相比具有較高升液能力，較低剪切力，較短混合時間，在高濃度下具有高得多的溶解氧系數，表明有用于剪切力敏感的生 物系統的巨大潛力。一種升流式生物反應器 (liftstreambioreactor)利用罐中心一根連有多孔板的桿上下移動達到攪拌的目的，可用于培養(yǎng)剪切力敏感細胞。其主要類型有鼓泡式反應器、氣升式反應器和轉鼓式反應器等。但由于鼓泡式反應器對氧的利用率較低，如果用較大通氣量，則產生的剪切力會損傷細胞。較大氣泡或較高氣速導致較高剪切力，從而對植物細胞有害。通過胡蘿卜細胞培養(yǎng)研究發(fā)現，比較攪拌罐、氣體噴射罐和帶通氣管的氣升式反應器，最高細胞濃度和最短倍增時間可從氣升罐中得到。過量供氣，過高的氧濃度反而會影響細胞的生長和次生代謝產物的合成。轉鼓式反應器用于煙草細胞懸浮培養(yǎng)的研究發(fā)現，與有一個通風管的氣升式反應器相比，相同條件下轉鼓式反應器中生長速率高，其氧的傳遞及剪切力對細胞的傷害水平方面均優(yōu)于氣升式反應器。小規(guī)模實驗往往采用外部光照，反應器表面有透明的照明區(qū)，光源固定在反應器外部周圍。 Mori 等發(fā)明的反應器將多個透明圓柱體平行安裝在反應器罐內，光源放置在透明圓柱體中，供給 CO2 的氣體交換器在罐內兩個圓柱之間。大的光生物反應器通過增加單元數目得到。由于發(fā)光體并非機械固定在反應器上，且通過玻璃管與發(fā)酵液分離，因此反應器可高壓滅菌，而發(fā)光體在冷卻后插入玻璃管。 （四）親和層析生物反應器 親和層析生物反應器（ affinity chromatography bioreactor (ACBR)） 利用一個標準的反應器，加一個親和層析柱，用于分離收集培養(yǎng)產生的目標蛋白。