【正文】 factor) A?(I‖?I?)/(I‖+2I?) (I‖+2I?)表示發(fā)射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及與入射光軸垂直的兩個(gè)方向上的分量。 由于單色器和光電倍增管等對(duì)垂直和水平兩個(gè)偏振成分的敏感度可能不同，因而嚴(yán)格的測(cè)定需要引入校正因子 G，定義 G為水平偏振光激發(fā)樣品時(shí)，儀器對(duì)垂直偏振光的透射效率與對(duì)水平偏振光透射效率之比，為 G?IHV/IHH IHV為起偏器水平取向而檢偏器垂直取向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度 ， IHH為起偏器和檢偏器均為水平取向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度 。 如圖所示 ， 假設(shè)沿 z軸振動(dòng)的平面極化光由 x軸入射原點(diǎn)， 在原點(diǎn)有熒光分子 ， 受其激發(fā)后此分子發(fā)射極化熒光 ，在 y軸收集極化熒光 ， 令 I‖為沿ｚ軸振動(dòng)的極化熒光 ， 令 I?為沿ｘ軸振動(dòng)的極化熒光 。 Tformat for polarization measurements. DET, detector。 在分子朝向無規(guī)律但分子不能自由運(yùn)動(dòng)的溶液中 ，Ｐ的值稱為本征極化率 P0。 電偶極子發(fā)射的熒光在與電偶極子方向垂直的方向上最強(qiáng) （ 即熒光傳播方向與電偶極子方向垂直的熒光最強(qiáng) ） ， 在與電偶極子平行的方向上最弱 。 熒光偏振是指物質(zhì)在受激發(fā)時(shí)發(fā)射的熒光常為偏振光這樣一種性質(zhì) ?？梢酝ㄟ^對(duì)極化熒光的分析確定分子的大小、形狀和流動(dòng)性等性質(zhì)。 當(dāng)然，實(shí)際上儀器因子 Z與波長(zhǎng)是有關(guān)的，這就使得激發(fā)譜與吸收譜并不完全相似。Z 式中 ? (?A)為激發(fā)波長(zhǎng) ?A處的消光系數(shù)， Ｃ 為樣品分子的濃度， I0為入射光強(qiáng)度， I0為透過樣品后的光強(qiáng)度， L為光程（樣品池光徑） 如果激發(fā)光強(qiáng)保持不變，且 ?和 Z與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)，則 F? ?(?A) 很顯然，熒光強(qiáng)度與樣品在波度 ?A處的消光系數(shù)有關(guān)，而消光系數(shù)與激發(fā)波長(zhǎng)是密切相關(guān)的，消光系數(shù)隨波長(zhǎng)的變化即吸收譜，因此熒光強(qiáng)度也隨激發(fā)波長(zhǎng)的變化而變化。L 因此儀器測(cè)到的熒光強(qiáng)度 Ｆ ? IA? Z， 這里 Z是儀器因子 。 熒光強(qiáng)度 熒光強(qiáng)度 F取決于激發(fā)態(tài)的初始分布 IA與量子產(chǎn)率 ? 的乘積 。 量子產(chǎn)率的改變必然會(huì)引起熒光強(qiáng)度的改變 。 Fluorophores are pared using the ratio of their fluorescence yields ? Often fluorophores are pared using the ratio of their fluorescence yields. ? As we see in Figure , this relative fluorescence yield will depend on the wavelength chosen for observation because of the shapes of the fluorescence spectra. Figure The relative fluorescence yield is defined for a single wavelength and depends on the wavelength chosen for observation. 由于各種競(jìng)爭(zhēng)性過程而使熒光量子產(chǎn)率減小的現(xiàn)象稱為淬滅 (quenching)， 如溫度淬滅 、 雜質(zhì)淬滅等。 后面將要證明 :對(duì)稀溶液來說 ， 熒光強(qiáng)度 F與吸收度 A成正比 : F?kI0A ? 這里 k是比例常數(shù) ， I0是吸收前的光強(qiáng)度 ， ? 是熒光量子產(chǎn)率 。 發(fā)射量子數(shù) ? ? ????? 吸收量子數(shù) ?的絕對(duì)值是較難用實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)量的 ， 因?yàn)楸仨毷孪戎纼x器的修正因子 。 量子產(chǎn)率 (quantum yield) 熒光量子產(chǎn)率是物質(zhì)熒光特性中最基本的參數(shù)之一 ， 它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率 。 躍遷時(shí)間是躍遷頻率的倒數(shù) ， 而壽命是指分子在某種特定狀態(tài)下存在的時(shí)間 。 從下式可以得到 ?F的粗略估計(jì)值 (單位為秒 )。 壽命 ?和這些過程的速率常數(shù)有關(guān) ， 總的退激過程的速率常數(shù) k可以用各種退激過程的速率常數(shù)之和來表示 : k?kF+?ki ki表示各種非輻射過程的衰減速率常數(shù) 。 ?F表示熒光分子的固有熒光壽命 ， kF表示熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù) 。 如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量 ， 則熒光壽命與熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù)成反比 ， 熒光發(fā)射速率即為單位時(shí)間中發(fā)射的光子數(shù) ， 因此有 ?F ? 1/KF。 事實(shí)上 ， 在瞬間激發(fā)后的某個(gè)時(shí)間 ， 熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值 ， 然后熒光強(qiáng)度將按指數(shù)規(guī)律下降 。 假定在時(shí)間 ?時(shí)測(cè)得的 It為I0的 1/e， 則 ?是我們定義的熒光壽命 。 熒光壽命 (fluorescence lifetime) 去掉激發(fā)光后 ， 分子的熒光強(qiáng)度降到去掉激發(fā)光時(shí)熒光強(qiáng)度 I0的 1/e所需要的時(shí)間 ， 稱為熒光壽命， 常用 ?表示 。 激發(fā)譜和吸收譜的關(guān)系 由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)有相似的振動(dòng)能級(jí)分布 ， 而且從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率與由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率也相近 ， 因此吸收譜與發(fā)射譜呈鏡象對(duì)稱關(guān)系 。 激發(fā)譜是熒光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下測(cè)得的某一波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度的變化情況 ， 也就是不同波長(zhǎng)的激發(fā)光的相對(duì)效率； 發(fā)射譜則是某一固定波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下熒光強(qiáng)度在不同波長(zhǎng)處的分布情況 ， 也就是熒光中不同波長(zhǎng)的光成分的相對(duì)強(qiáng)度 。 例如 ， 生色團(tuán)及其環(huán)境的變化過程在紫外可見吸收的 1015秒的過程中基本上是靜止不變的 ， 因此無法用紫外可見吸收光譜檢測(cè) ， 但可以用熒光光譜檢測(cè) 。 激發(fā)態(tài)的壽命取決于輻射與非輻射之間的競(jìng)爭(zhēng) 。 紫外和可見熒光涉及的是電子能級(jí)之間的躍遷 ， 熒光產(chǎn)生包括兩個(gè)過程：吸收以及隨之而來的發(fā)射 。 熒光光譜能提供較多的參數(shù) ， 例如激發(fā)譜 、 發(fā)射譜 、 峰位 、 峰強(qiáng)度 、 熒光壽命 、 熒光偏振度等 。 ?In discussing absorption we have been concerned entirely with the excitation of a molecule from its ground state to a higher energy level and have given no consideration to the subsequent fate of the excited molecule. ? In many cases the sequel is not very interesting。 我們這里要介紹的熒光 ， 是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見光后發(fā)出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紫外熒光或可見熒光 。熒光光譜 參考書 趙南明 ， 周海夢(mèng) . 生物物理學(xué) ， 高等教育出版社 ，2022 Emission Spectroscopy, Chapter 11, in . van Holde, . Johnson and . Ho eds. Principles of Physical Biochemistry, PrenticeHall, 1998 某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射時(shí) ， 會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的光 ， 如果這個(gè)時(shí)間比較短 ， 這種光就稱為熒光 。 熒光由一種能發(fā)熒光的礦物 ?? 螢石 (fluospar)而得名 。 除了紫外光和可見光可能激發(fā)熒光外 ， 其它的光如紅外光 、 X射線也可能激發(fā)出熒光 ， 因此除紫外熒光或可見熒光外 ， 還有紅外熒光 、 X射線熒光等 。 the energy is transferred as heat to the surroundings. ? In some cases light is emitted by the sample either as fluorescence or phosphorescence. ? We will discuss the general characteristics of emission and ignore the exceptions. 熒光光譜的特點(diǎn) Barak and Webb demonstrated that as few as 30 fluorescent dye molecules bound to low density lipoprotein molecules can be detected on cell surfaces by microscopy using a sensitive video camera. With even more sophisticated methods others have moved toward detection of single fluorophore molecules in a laserexcited flow stream. Because this sensitivity can bine with ease of use and the potential for multiparameter analysis, fluorescence has bee widely used in biology and medicine. Fluorescence is a sensitive technique for detecting biological materials 熒光光譜靈敏度高的原因 熒光輻射的波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng) ， 測(cè)量到的熒光頻率與入射光的頻率不同； 熒光在各個(gè)方向上都有發(fā)射 ， 因此可以在與入射光成直角的方向上檢測(cè)； 這樣 ， 熒光不受來自激發(fā)光的本底的干擾 ，靈敏度大大高于紫外 可見吸收光譜 ， 測(cè)量用的樣品量很少 ， 且測(cè)量方法簡(jiǎn)便 。 熒光光譜還可以檢測(cè)一些紫外 可見吸收光譜檢測(cè)不到的時(shí)間過程過程 。 每個(gè)過程發(fā)生的時(shí)間與躍遷頻率的倒數(shù)是同一時(shí)間量級(jí) (大約 1015秒 )， 但兩個(gè)過程中有一個(gè)時(shí)間延擱 ， 大約為 108秒 ， 這段時(shí)間內(nèi)分子處于激發(fā)態(tài) 。由于熒光有一定的壽命 ， 因此可以檢測(cè)一些時(shí)間過程與其壽命相當(dāng)?shù)倪^程 。 熒光光譜第二個(gè)特點(diǎn)是 信息量較大 基本原理 Fluorescence ? Fluorescence is emission from a singlet state, where the electron spins in the molecule are paired. Fluorescence ? excitation by absorption of energy ? loses energy as heat by internal conversion ? the molecule hesitates at the lowest vibrational level of the first singlet, because a relatively large amount of energy must be lost to go to the ground state. ? during this hesitation one of three things may happen: ? the molecule may fluoresce ? it may convert to the triplet (intersystem crossing) ? it may go to the ground state without emitting a photon (a nonradiative transition). EMISSlON LlFETlMES Emission lifetimes of absorption, fluorescence, and phosphorescence at the equilibrium internuclear distance of the ground state. 儀器結(jié)構(gòu) FLUORESCENCE INSTRUMENTATlON Diagram of a simple fluorescence instrument Filter Fluorometers Instruments in which wavelength selection is acplished with filters are generally referred to as fluorometers, whereas monochromatorbased instruments capable of spectral scanning are called spectrofluorometers. The simplest, least expensive, fluorometers are single beam filter instruments with halogen lamp sources, phototube or PMT de