【正文】 這種測定生色團距離的方法 ， 常被人稱為光譜尺 。 R0可以根據(jù)受體的吸收譜和供體的發(fā)射譜 、 介質(zhì)的折射系數(shù) 、 供體和受體躍遷電偶極矩的朝向因子 、 供體在沒有受體存在時的量子產(chǎn)率等參數(shù)估算出來 。則當?shù)谝环N熒光團被激發(fā)時，另一種熒光團卻因第一種生色團激發(fā)能的轉(zhuǎn)移而被激發(fā)，這種現(xiàn)象稱為共振能量轉(zhuǎn)移。 表明隨作用時間的增加 ， 該蛋白質(zhì)逐漸變性 ， 發(fā)生去折疊 ， 蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光生色團逐漸暴露在極性水環(huán)境中 。 因此 ， 可以利用熒光強度的變化估算出光合效率的高低 。 如果反應中心的光化學反應由于某種原因受阻 ， 則熒光產(chǎn)率會增高 。 ?光合系統(tǒng)中的天線色素如葉綠素吸收太陽光的光能后被激發(fā)到能量較高的激發(fā)態(tài) ， 然后會以各種形式耗散其吸收的能量 ， 弛豫回到基態(tài) 。 植物 、 藻類或光合細菌中含有各種色素和輔助色素分子 ， 包括葉綠素 a、 b、 c c2， 類胡蘿卜素如 ?胡蘿卜素 、 巖藻黃質(zhì) 、 多甲藻黃素 ，藻膽素如藻藍素 、 藻紅素等 ， 都含有熒光生色團 ， 它們的熒光激發(fā)譜和熒光發(fā)射譜都可用來鑒定色素的存在及含量 ， 也可以用來分析光合作用過程中能量的吸收與傳遞 。 維生素 B12在 pH7的溶液中 ， 可以用 275nm激發(fā) ， 305nm處檢測 。 例如 ， 可用345nm激發(fā) ， 490nm處測量 ， 用以確定血液中維生素 A的含量 。 ?結(jié)合的探針不應影響被研究的大分子的結(jié)構(gòu)和特性 。 ?探針與被研究分子的某一微區(qū)必須有特異性的結(jié)合 ， 而且結(jié)合得比較牢固 。 熒光探針 總的來說，天然的熒光生物分子種類很有限，而且熒光強度較弱，為了研究多數(shù)的不發(fā)光的生物分子，人們廣泛利用一類能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光的分子，把這些小分子和大分子結(jié)合起來，或者插入大分子中，根據(jù)這些較小的熒光分子性質(zhì)的改變，分析大分子的結(jié)構(gòu)，這類小分子稱為熒光探針。 生物化學中主要的熒光生色團 ? 生物化學中主要的熒光生色團可分為兩類 : ? 天然熒光生色團 ? 熒光指示劑（熒光探針） 主要的天然熒光生色團 ? 蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸 ? 核黃素、維生素 A、葉綠素等天然色素和NADH等少數(shù)分子 ? 核酸中 tRNA中的 Y堿基（二氫尿嘧啶） 蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團 吸 收 熒光 熒光敏感度 熒光生色團 條件 ? max ( 納米 ) ? max ( ? 1 0 3) ? max ( 納米 ) ? F ? F (ns) ? max ? F ( ? 1 0 2) Tr p H 2 O pH 7 280 348 11. Tyr H 2 O pH 7 274 303 Phe H 2 0 pH 7 257 282 Y base Ye ast t RNAP he 320 460 在蛋白質(zhì)的熒光譜中，由色氨酸殘基發(fā)出的熒光占統(tǒng)治地位。 ? 取代基的類型和位置 。 ? 分子的幾何排布：具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機分子容易發(fā)熒光 。絕大多數(shù)熒光物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán) 。 粘度對熒光偏振度的影響 隨著粘度的提高 ， 熒光偏振度也會上升 。 除上述可能影響熒光壽命的因素之外 ， 實際中要注意的是 ， 不同測量方法測出的壽命也會有一定差別 。 分子內(nèi)環(huán)境與熒光壽命 生色團在分子內(nèi)的環(huán)境也會影響熒光壽命 ，正是由于這個原因 ， 熒光壽命才被用來分析分子內(nèi)不同的生色團所處的環(huán)境 。 這種現(xiàn)象不是由于二聚體的形成 ， 而是由于自吸收 。例如前面提到的 酸緩沖液，能使酪氨酸的熒光壽命從 ns縮短到 ns。 區(qū)分散射光和熒光發(fā)射的依據(jù) ， 是散射光與激發(fā)光波長相同 ， 離熒光峰較遠； 熒光污染 也是影響熒光強度的一種因素： ?洗滌器皿的合成去污劑常能產(chǎn)生很強的熒光； ?分液偏斗上涂的潤滑油也有很強的熒光； ?溶液中微生物的產(chǎn)生； ?濾紙中的雜質(zhì)； 表面吸咐 也會對稀溶液的熒光測定造成影響 。 例如熒光物質(zhì) TNS在不同濃度的蔗糖水溶液中 ， 熒光強度隨粘度增加而增加 。 溶液粘度對熒光強度的影響 熒光強度一般隨介質(zhì)粘度的升高而增強 。 利用這些物質(zhì)對 pH值的敏感性， 可以將它們用作 pH指示劑 ， 或利用它們在不同 pH值溶液中熒光強度的改變來判斷酸堿滴定的終點 （ 特別是在有色或混濁的溶液中 ） 。 如洗液中的重鉻酸鉀 ， 其兩個吸收峰恰好在色氨酸的激發(fā)和發(fā)射峰附近 ， 會吸收色氨酸的激發(fā)能及其發(fā)射的熒光 （ 內(nèi)濾光效應 ） 因此熒光器皿不能用洗液來洗 。 Ⅴ. 共振能量轉(zhuǎn)移：（略） 總的來說 ， 為克服雜質(zhì)淬滅帶來的問題 ，對所使用的溶劑或緩沖液 ， 首先要考慮其對所使用的熒光物質(zhì)是否有直接作用 。 氧在弱極性溶劑中的溶解度比較高 ， 例如氧在乙烷中的溶解度約為在水中的幾倍 。 引起淬滅的一種最常見的物質(zhì)是處于三線態(tài)的活性氧 。 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應的淬滅劑并不限于金屬離子 。 某些淬滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時會發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應 ， 即氧化 ?還原反應 ， 從而引起熒光淬滅 。 只有在低溫下， 由三線態(tài)返回基態(tài)而放出波長的磷光 。 Ⅲ . 含溴 、 含碘化合物 、 硝基化合物 、 重氮化合物 、 羰基化合物 、 羧基化合物及某些雜環(huán)化合物容易由單線態(tài)轉(zhuǎn)變至三線態(tài) 。 Ⅱ . 組成化合物導致熒光淬滅：一部分熒光分子與淬滅劑分子作用而形成絡合物 。 例如中性的 M磷酸緩沖液能淬滅酪氨酸的熒光 。 雜質(zhì)對量子產(chǎn)率 （熒光強度）的影響 除熒光分子之外的其它分子與熒光分子的相互作用使熒光量子產(chǎn)率減少的現(xiàn)象統(tǒng)稱為雜質(zhì)淬滅 。 濃度淬滅的現(xiàn)象有時也可以加以利用 ， 例如在脂質(zhì)體里包裹高濃度的熒光染料 ， 由于濃度淬滅 ，包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的熒光染料熒光強度很低 。 即使是樣品池中心區(qū)域內(nèi)能被激發(fā)的熒光分子 ， 它們發(fā)出的熒光又可能被它們與檢測器之間的熒光分子吸收 （ 如果物質(zhì)本身的吸收光譜和發(fā)射光譜有重疊的話 ） ， 這樣 ， 大部分熒光分子發(fā)射的熒光在離開吸收池前就又被吸收 。 產(chǎn)生濃度淬滅的另一個重要原因之一是：當溶液較濃時 ， 激發(fā)光一進入溶液 ， 就被靠近光源一側(cè)的樣品池壁的熒光分子大量吸收 ， 這樣 ， 越進入溶液 ， 發(fā)熒光分子越少 ， 因而大量的激發(fā)光在到達池中心之前就被吸收了 。 對于濃度淬滅產(chǎn)生的原因最簡單的解釋是：激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而自淬滅 。 只有樣品濃度很稀時 ， F? K I0 ? [1?(1?? l c)]?K I0 ? ? l C II. 熒光濃度過大時 ， 常常發(fā)生淬滅現(xiàn)象。 這是因為： 熒光強度 F? K ? ? I0 (1?e?? l c)， 這里 K 是儀器常數(shù) ， ? 是量子產(chǎn)率 ， I0 是激發(fā)光強度 ， ? 是克分子消光系數(shù) ， l是樣品池光徑 ， C是樣品濃度 。 樣品濃度對熒光強度的影響 在樣品濃度較低時 ， 熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比 。 如果溶液中有淬滅劑存在 ， 則淬滅劑的作用也會隨溫度升高而增大 。 溫度升高 ， 熒光強度減弱的原因主要是溶液的粘度減小 ， 溶劑與溶質(zhì)分子的動能增加 ， 使得熒光分子的其它分子之間的碰撞幾率增加 ， 激發(fā)態(tài)熒光分子通過分子間碰撞或分子內(nèi)能量的轉(zhuǎn)移 ，將自己的能量轉(zhuǎn)移出去 。 溫度每升高 1?C，熒光減弱的百分數(shù)稱為溫度系數(shù) 。 尤其是對于稀溶液來說 ， 光化分解就更為嚴重。 一種可能的機制是：在非極性的溶劑中系間交連 （ 轉(zhuǎn)移到另外的激發(fā)態(tài) ）的速率會減少 。 溶劑（或環(huán)境）極性的影響 量子產(chǎn)率 （ 熒光強度 ） 會隨著溶劑 （ 或環(huán)境 ） 極性的減小而增加 。 顯然 ， 共振能量轉(zhuǎn)移對 ?max可能造成影響 。 當蔗糖濃度由 10%增加到60%， 粘度從 58分泊 ， ?max從580 nm蘭移到 555 nm。 利用這種效應 ， 可以將其熒光波長作為 pH值的指示劑 。 這是因為弱酸和弱堿分子和其離子在電子結(jié)構(gòu)上有所不同 ， 因而熒光 ?max也可能發(fā)生變化 。 因此在利用?max作為環(huán)境極性的探針時要十分謹慎 。 例如 ， 如果在激發(fā)態(tài)的壽命之內(nèi) ， 分子沒有足夠的時間來重新排列并降低激發(fā)態(tài)的能量 ， 則可能發(fā)生 ? max 蘭移的情況 。 例如 ，當溶劑的極性由乙二醇 、 甲醇 、 異丙醇到辛醇依次減小時 ， ANS（ 1氨基 8萘磺酸酯 ， 一種熒光探針 ， 常用于與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合 ） 的熒光譜發(fā)生蘭移 ， 量子產(chǎn)率提高 。 同一種熒光物質(zhì)在不同極性的環(huán)境中， 其 ?max 可能會有所差別 。 生色團與周圍溶劑分子的相互作用可能會先于發(fā)射而發(fā)生 ， 這種相互作用會改變激發(fā)態(tài)的能量及熒光發(fā)射的頻率 。 而在極性溶劑中 ?a??f 較大 ， 產(chǎn)生紅移 。 介電常數(shù)?不僅與偶極子取向有關(guān) ， 也與電子取向有關(guān) ， 上式中第一項 (???)/(2???)是電子和偶極子重新取向的結(jié)果；折射率 n與電子重新分布有關(guān) ， 因此上式中第二項是電子重新分布的結(jié)果 。 由于熒光分子激發(fā)態(tài)的偶極矩 ??一般要大于基態(tài)偶極矩 ?， 熒光分子偶極矩的增大與溶劑分子相互作用， 使溶劑分子的電子分布和偶極子取向發(fā)生變化 。 Solvent effects ? Solvent effects will affect the position of the fluorescence band. The effects of a solvent on fluorescence can be very large, and many studies of macromolecules use this fact. ? General solvent effects depend on the polarizability of the solvent, and increasing the dielectric constant usually shifts the fluorescence to longer wavelength. ? Specific solvent effects are the result of chemical reaction of the excited state with the solvent. Important chemical reactions include: ? hydrogenbonding ? acidbase chemistry ? the formation of chargetransfer plexes where an electron in the fluorophore is transferred to another group on excitation. General solvent effects ? General solvent effects involve the interaction of the permanent dipole moment of the molecule in both the ground and excited states with the reactive field induced in the surrounding solvent. ? The reactive field has two parts: ? the immediate reaction of the electrons of the solvent molecules ? the slower reorientation reaction of the solvent molecules as a whole due to their own permanent dipole moment. 溶劑影響的結(jié)果可以用 Lippert方程來描述： ＋常數(shù) 其中 ， ?a與 ?f分別為熒光分子的吸收波數(shù)與發(fā)射波數(shù) ， ?a??f 反映了吸收光與發(fā)射光能量的差別；?為溶劑的介電常數(shù)； h為普朗克常數(shù)； c為光速 ，a為熒光分子在溶劑中的半徑 ， ?與 ??分別為熒光分子處于基態(tài)和激發(fā)態(tài)時的偶極矩 。有時 ， 為了得到可靠的結(jié)果 ， 實驗設計和操作中需要考慮和設法減少這些因素的影響；有時 ， 也可巧妙地利用熒光參數(shù)對環(huán)境困素的敏感性來達到我們的目的 。 但正因為其靈敏度高 ， 因此也容易受到各種因素的干擾 。 環(huán)境對熒光參數(shù)的影響 熒光分析的主要特點是靈敏度高 。 但有時也用毫微秒量級的偏振光脈沖來測量 I‖ 和 I?的時間函數(shù) 。 經(jīng)校正后的熒光偏振度 Ｐ ?(IVV?GIVH)/(IVV+GIVH) 定義 不對稱度 (或熒光 各向異性， anisotropy