【正文】 測(cè)定磷酸鹽緩沖溶液的配制：稱取25g磷酸二氫鉀，倒入500ml燒杯中，加入20ml磷酸，待磷酸二氫鉀全溶后加入蒸餾水稀釋。20個(gè)培養(yǎng)皿分兩組平行操作，每個(gè)梯度分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組(B)和空白組(A)，空白組用無(wú)菌水代替溶菌酶溶液。細(xì)菌的活化與擴(kuò)增：在無(wú)菌條件下，從已保存的菌種斜面上挑選單一菌落，轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，37℃水平搖床上培養(yǎng)3h，37℃培養(yǎng)8h。 溶菌酶酶性的測(cè)定(1)溶菌酶的抑菌作用培養(yǎng)基的制備：液體培養(yǎng)基：3g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，蒸餾水定容到1000ml；固體培養(yǎng)基：3g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g瓊脂，蒸餾水定容到1000ml[15]。染色、脫色：電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長(zhǎng)短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動(dòng)，即將膠面與一塊玻璃板分開(kāi)，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)基中染色，%的考馬斯亮藍(lán)染液染色，過(guò)夜。電泳：加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)后，樣品進(jìn)膠前電流控制在15~20mA，大約15~20min；樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠后，電流升到30~45mA，電泳過(guò)程保持電流穩(wěn)定。加樣：用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板使其松開(kāi)，然后取下玻璃膠室去掉密封的硅膠框，注意在上述過(guò)程中手始終給玻璃膠室一個(gè)夾緊力，在將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽，插入斜板，將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上，外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可，注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)水泡。在100℃水浴中處理2min，冷卻至室溫后備用。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，制備濃縮膠，用長(zhǎng)滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子；待濃縮膠聚合后，小心把出樣品模子[14]。然后用細(xì)滴管或注射器仔細(xì)注入少量水。凝膠的聚合：首先制備分離膠，然后將凝膠液沿凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)面緩慢用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。4℃冰箱保存電極緩沖液（）：SDS 1g，Tris 3g，Gly ，加蒸餾水溶解定容到1000ml。外包錫紙，4℃冰箱保存，30天內(nèi)使用分離膠緩沖液（）:Tris ,加蒸餾水溶解，6mol/L，定容100ml。至恒溫培養(yǎng)箱中40℃條件下干燥稱重。待有晶體析出后。加入5％CaCl2溶液將溶菌酶聚丙烯酸解離，至無(wú)沉淀析出，然后過(guò)濾，得到澄清溶液[13]。吸附：將過(guò)濾后的澄清溶液用20％，在調(diào)pH值的過(guò)程中不停的攪拌，有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15％的聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出．，靜置17個(gè)小時(shí)進(jìn)行傾析，得到粘附于底部的乳白色膠狀物。棄掉濾渣。3個(gè)小時(shí)以后，發(fā)現(xiàn)溶液基本澄清。保持溫度為40℃，氯化鈉濃度為2%、進(jìn)行抽提；，氯化鈉濃度為2%不變，分別保持溫度為25℃（室溫）、30℃、35℃、40℃和45℃條件進(jìn)行抽提；，溫度40℃不變，%、1%、%和2%、%進(jìn)行抽提。抽提：稱取750g清洗干凈的蛋殼用900ml的一定濃度的NaCl溶液泡后，用2mol但溶菌酶在雞蛋殼中含量很低，所以我將采用聚丙烯酸沉淀法從廢棄蛋殼中提取溶菌酶進(jìn)行初步的研究，將經(jīng)過(guò)提、除雜蛋白、吸附、鹽析等一系列步驟成功地提取出蛋殼中的微量溶菌酶，討論不同的條件對(duì)抽提的影響；本試驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，在溶菌酶酶活性質(zhì)研究過(guò)程中，以枯草芽孢桿菌作為研究對(duì)象，研究溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用及在不同的抽提條件下提取的溶菌酶的酶活力。目前雖然對(duì)溶菌酶的研究較多，但是缺乏適于工業(yè)化生產(chǎn)溶菌提取的可行性工藝及溶菌酶在食品中的研究，對(duì)溶菌酶的性質(zhì)等的報(bào)道也說(shuō)法不一，為了更好的將溶菌酶應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)中，有必要對(duì)溶菌酶的提取、性質(zhì)及應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)性的研究本試驗(yàn)即以綜合利用蛋殼為目的，研究了適宜工業(yè)化生產(chǎn)的溶菌酶提取工藝，該工藝具有工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、提取效率髙、酶活力較高、成本低、生產(chǎn)周期短、可連續(xù)生產(chǎn)的特點(diǎn)，并對(duì)溶菌酶的穩(wěn)定性、抑菌能力等也進(jìn)行了研究，為溶菌酶的應(yīng)用提供可行性依據(jù)[10]。已有研究表明，蛋殼含有豐富的鈣、角蛋白、粘多糖、溶菌酶等成分，又基于蛋殼資源數(shù)量巨大，永不衰竭，綜合利用深度加工就顯得特別必要。我國(guó)的廢棄蛋殼主要來(lái)源于大量消費(fèi)雞蛋的食品廠、孵化場(chǎng)、酒家等單位，而成批拋棄的蛋殼很快就會(huì)腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境污染，在不遺余力地尋求解決垃圾污染、破壞環(huán)境的措施時(shí)，垃圾的減量化、資源化則是最具積極意義的，最值得提倡的。本實(shí)驗(yàn)就是從廢棄的蛋殼中提取出溶菌酶。 課題研究目的和意義溶菌酶存在于自然界的動(dòng)物植物微生物中，除了人體之外，蛋清中的含量最為豐富，蛋殼膜中也有存在。 超濾法超濾法是一種新興的分離純化物質(zhì)的技術(shù)，它是利用濾膜的孔徑大小來(lái)篩分不同的物質(zhì)，達(dá)到過(guò)濾雜質(zhì)，使得水以及小分子物質(zhì)通過(guò)，從而獲得產(chǎn)物的效果，一般在反滲析和濃縮等方面應(yīng)用得多，近來(lái)也在蛋白質(zhì)的分離純化中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。聚乙二醇／葡聚糖和聚乙二醇／無(wú)機(jī)鹽是常用的雙水相體系，由于葡聚糖價(jià)格昂貴，因此聚乙二醇／無(wú)機(jī)鹽體系應(yīng)用更為廣泛。兩相的組成和密度均不相同，通常密度較小的一相浮于上方，為上相；密度較大的一相沉于下方，為下相。這種反膠團(tuán)的有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)水溶液混合時(shí)，一定條件下，蛋白質(zhì)分子能夠從水相進(jìn)入到反膠團(tuán)的中心水池，經(jīng)過(guò)分相后，再將有機(jī)相與另一水相接觸，改變條件，即可打開(kāi)膠團(tuán)，釋放蛋白質(zhì)分子，從而達(dá)到萃取分離的目的。 反膠團(tuán)萃取法當(dāng)表面活性劑溶于大量與水不相溶的有機(jī)溶劑中，達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)形成極性頭在內(nèi)，非極性頭在外的聚集體，這種聚集體為反膠團(tuán)。用螯合劑將特定的金屬離子固定在固體表面會(huì)減少蛋白質(zhì)一金屬相互反應(yīng)的自由度，蛋白質(zhì)因此不容易失活，可以保持較高的活性。親和膜色譜技術(shù)是兼具膜分離與親和分離的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的膜分離、親和色譜相比，不僅具有純化倍數(shù)高，壓降小，分離時(shí)間短，生物大分子在分離過(guò)程中變性幾率小，允許較快的加料速度等特點(diǎn)，而且比柱親和色譜更易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。由于生物親和相互作用的選擇性高，離心分離法操作簡(jiǎn)便、易于放大，因此親和沉淀法不僅具有接近于親和層析法的純化效率，而且可彌補(bǔ)親和層析法放大困難的缺點(diǎn)。它包括親和沉淀法，親和過(guò)濾法，親和膜分離法，固定金屬親和層析法等各類方法。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑。目前，利用親和層析法分離溶菌酶的報(bào)導(dǎo)有很多。親和色譜在凝膠過(guò)濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，并且它們的結(jié)合是可逆的，在改變流動(dòng)相條件時(shí)二者還能相互分離。目前國(guó)內(nèi)外在分離溶菌酶時(shí)最常用的樹(shù)脂有72732弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，201大孔離子交換樹(shù)脂，Duolite464離子交換樹(shù)脂、醋酸纖維素(PC)、羧甲基纖維素和羧甲基瓊脂糖等。離子交換層析法是制備高純度的溶菌酶時(shí)，最常用的方法。其基本原理是通過(guò)膜蒸餾來(lái)脫除溶液中的溶劑，濃縮溶液，使溶液達(dá)到過(guò)飽和并通過(guò)膜表面的誘導(dǎo)作用而形成晶體[8]。而膜結(jié)晶作為一種新的結(jié)晶方法受到越來(lái)越多的注意和重視。但是蛋白質(zhì)的結(jié)晶是一個(gè)十分復(fù)雜的物理化學(xué)過(guò)程，晶體的形成，一方面受到自身分子的結(jié)構(gòu)影響，另一方面受到結(jié)晶條件的影響，導(dǎo)致的結(jié)果是結(jié)晶過(guò)程的細(xì)微差別，將得到不同產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至不同形態(tài)的晶體?？筛鶕?jù)要求純度的不同，將析出的溶菌酶晶體過(guò)濾，然后再溶解，通過(guò)同樣的方法重結(jié)晶，以達(dá)到更高的純度。 結(jié)晶法結(jié)晶法是一種傳統(tǒng)的制備溶菌酶晶體的方法，由于溶菌酶具有耐熱和耐酸，以及在鹽溶液中穩(wěn)定好，溶解性強(qiáng)的特點(diǎn)，結(jié)晶過(guò)程可以通過(guò)改變?nèi)芤旱臈l件，來(lái)使溶菌酶在溶液中以晶體態(tài)析出。目前，世界上只有美國(guó)、加拿大、日本等少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)行了工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，我國(guó)起步較晚，且存在提取率低、處理量小和產(chǎn)品比活低等缺點(diǎn)[6]。HungMin chang (2000)采用還原劑（抗壞血酸）與熱處理結(jié)合提取雞蛋和鴨蛋淸溶菌酶，最大收率為78%。Chingchuan yang (1998)利用陰離子多糖分離溶菌酶。施德恒（1992)采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂CMSephadex抽提雞蛋殼膜中溶菌酶。趙哲勛（1993)利用D201大孔離子交換樹(shù)脂從雞蛋殼膜中提取溶菌酶，他釆用靜態(tài)吸附，再經(jīng)洗脫、鹽析、透析純化得到了活力較髙的成品，活力13000。Durance (1988) 利用兩步法即離子交換等電點(diǎn)沉淀同步分離蛋清中溶菌酶和抗生物素蛋白，得到高純度、髙活力的溶菌酶和抗生物素蛋白。Alderton (1945)及Cardon (1945)采用彭潤(rùn)土吸附溶菌酶，再用5%吡啶溶出得到溶菌酶。1945年，奧爾德頓等人用彭潤(rùn)土巖吸附，再用吡啶溶出從雞蛋清中得到了收率較髙、結(jié)晶好的溶菌酶，第二年他們開(kāi)發(fā)出直接結(jié)晶法，即在