w03細(xì)胞生物學(xué)研究方法-文庫(kù)吧資料
2025-01-14 11:43本頁(yè)面
【正文】 用不同離心速度所產(chǎn)生的離心力差別 ， 可將大小不同的亞微結(jié)構(gòu)顆粒分離開(kāi) ， 此法適用于分離沉降速率差別較大的亞微結(jié)構(gòu)顆粒 ， 而對(duì)于差別較小的則應(yīng)采用密度梯度離心法 。 （ 五 ） 超速離心技術(shù) ultracentrifugation ? 是細(xì)胞生化分析研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法 ， 是分離純化細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)和生物大分子的重要技術(shù)手段 ， 超離心可達(dá)幾萬(wàn) —— 幾十萬(wàn)轉(zhuǎn) /分 （ g） 的高轉(zhuǎn)速 ， 各種細(xì)胞亞微顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率不一樣 ， 衡量各種物質(zhì)顆粒在單位強(qiáng)度離心場(chǎng)中沉降速率的量度 ， 稱為沉降系數(shù) 。 ?其操作過(guò)程： ? （ 1） 同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)樣品 ? （ 2） 樣品標(biāo)本制備 （ 包括固定 、 包理 、 切片 or 超薄切片 or 滴片 ） ? （ 3） 涂布乳膠 （ 在暗室 ） ? （ 4） 曝光 （ 自顯影 ， 在暗盒內(nèi) ） ? （ 5） 顯影 、 定影 、 清洗 ? （ 6） 染色 ? （ 7） 光鏡下或電鏡下觀察 ? 由于放射性同位素標(biāo)記有對(duì)人不安全 ， 且操作步驟復(fù)雜 ， 費(fèi)時(shí)費(fèi)工的缺點(diǎn)：因此目前在基因定性研究方面大多改用非放射性標(biāo)記方式 —— 例如應(yīng)用生物素標(biāo)記或地高辛 標(biāo)記來(lái)替代同位素 ， 在生物素或地高辛上聯(lián)結(jié)熒光素或酶 ， 再以熒光顯微鏡或酶聯(lián)反應(yīng)來(lái)檢測(cè) ， 效果亦很好 。 圖 224 用流式細(xì)胞計(jì)分選細(xì)胞 （四）顯微放射自顯影 microradiography ? 依據(jù)照相原理利用放射性同位素所發(fā)射出來(lái)的射線 （ 主要是 β 粒子 ） 使感光材料 （ 照相乳膠 ） 上產(chǎn)生潛影 （ 此過(guò)程稱為 “ 曝光 ， ” 即讓照相乳膠上的 AgBr還原成 Ag） ， 再經(jīng)過(guò)顯影和定影 ， 即可觀察到用同位素標(biāo)記的某種物質(zhì)在標(biāo)本中的位臵和數(shù)量 。 目前 ， 最先進(jìn)的顯微光譜分析儀器是流式細(xì)胞光度計(jì) 。 ? 當(dāng)不存在抗原時(shí) ， 但隨機(jī)出現(xiàn)了沉積 （ 無(wú)論是否抗體與抗原結(jié)合 ， 熒光素都會(huì)沉積 ， 酶也與底物反應(yīng) ）故采用洗脫來(lái)避免此現(xiàn)象 。 ? (2)而間接法的不同之處是在抗原 —— 抗體初級(jí)的基礎(chǔ)上 ， 再增加一種能同初級(jí)抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的次級(jí)抗體 （ 即 “ 抗抗體 ” ） ， 從而使初級(jí)反應(yīng)得到“ 放大 ” ， 以增強(qiáng)分析觀察的靈敏性和準(zhǔn)確性 。 ? 再例： ? ori法顯示酸性磷（ pi） 酸酶（溶酶體標(biāo)志酶） （ 二 ） 免疫細(xì)胞化學(xué) : （ immunocytochemistry） 依據(jù)抗體能與對(duì)應(yīng)的抗原自行相互識(shí)別結(jié)合的免疫學(xué)原理來(lái)檢測(cè)特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況 ， 首先將某種抗體聯(lián)結(jié)上標(biāo)記物（ 光鏡觀察用的標(biāo)記物是熒光素 or 酶 ， 而電鏡觀察用的標(biāo)記物是膠體金 ） ， 再與組織 or 細(xì)胞樣品混合反應(yīng) ，隨后在光鏡 or 電鏡下檢查標(biāo)記物沉積的部位 ， 即對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定 ， 如果標(biāo)記物是熒光素時(shí) ， 則是在熒光顯微鏡下檢查熒光信號(hào)部位 ， 以顯示抗原存在位臵 。 掃描隧道顯微鏡原理 二 、 細(xì)胞生化分析 （ 一 ） 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色法（ histochemical and cytochemical staining methods） ? 利用某種顯色劑能與某種細(xì)胞成分特異性結(jié)合 ，顯示特定顏色的原理對(duì)組織和細(xì)胞內(nèi)某些成分進(jìn)行定位和定性分析的研究方法 ， 可對(duì)無(wú)機(jī)鹽蛋白質(zhì) ， 醛基 、碳水化合物 、 脂類 、 核酸和酶類等多種成分檢測(cè)鑒定 。 ? 缺點(diǎn)： ? （ 1） 分辨力不太高 ， 僅 3~10nm ? （ 2） 不能觀察樣品內(nèi)部 。 ? 特點(diǎn)：不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜處理 ， 即可觀察標(biāo)本的原始外表面 。 對(duì)于 “ 冰凍蝕刻處理的生物膜各個(gè)面 ， 國(guó)際上統(tǒng)一 （ 規(guī)定命名稱為 PS” 代表面向細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的表面 ） 。染色方法有正染、負(fù)染兩類，正染常采用醋酸鈾或檸檬酸鉛染色，使得被觀察的結(jié)構(gòu)較暗，背景較亮；負(fù)染則是使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結(jié)構(gòu)顯得明亮突出； ? （ 7）特殊的投影技術(shù)（真空噴鍍法）是對(duì)電鏡標(biāo)本的表面處理技術(shù)，即以真空噴鍍儀在真空條件下，將金、鉑等金屬微粒傾斜地噴向標(biāo)本，使其朝向發(fā)射原的表面沉積的金屬微粒多于背面，因而電鏡觀察時(shí)感覺(jué)反差極強(qiáng)，具立體感。因?yàn)楦咚龠\(yùn)動(dòng)的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞就會(huì)改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊，故要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水（真空中水易蒸發(fā) or升華，電子流與水分子相碰，改變其方向，使成像模糊）因此說(shuō)透鏡電鏡不能用來(lái)觀察活的樣品； ? （ 5）樣品厚度必須 900（即 90nm,） 這是因?yàn)殡娮哟┩改芰τ邢?，樣品過(guò)厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會(huì)產(chǎn)生熱量，將原樣品燒出白斑，所以透鏡電鏡觀察的樣品須超薄切片（ 400~500）不能用普通電鏡下的組織切片（ 2~7um）； ? （ 6） 標(biāo)本染色技術(shù)不同，電鏡標(biāo)本染色并不像光鏡標(biāo)本染色上各種顏色，而是使觀察的結(jié)構(gòu)與背景之間，黑白對(duì)比分明，反差強(qiáng)。 圖 212 JEM1011 透射電子顯微鏡 圖 213 萊卡超薄切片機(jī) 圖 214 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色） ? 特點(diǎn)： ? （ 1）照明光源不同； ? （ 2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同，是依靠改變磁透鏡的微磁電流強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的，也就是說(shuō)，電流強(qiáng)度的變化引起了磁場(chǎng)強(qiáng)度的改變，而磁場(chǎng)強(qiáng)度的變化又使電子射線的折射程度發(fā)生改變，因而放大倍數(shù)即隨之出現(xiàn)變化； ? （ 3）有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)，電子流的發(fā)射速度及波長(zhǎng)皆取決于電壓的高低。 圖 25 激光共聚焦掃描顯微鏡
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