w03細(xì)胞生物學(xué)研究方法-文庫(kù)吧
2024-12-24 11:43 本頁(yè)面
【正文】 是將相差顯微鏡的構(gòu)件顛倒裝配 ， 本末倒臵而成的 ， 并裝有恒溫設(shè)備 ， 閉路電視和縮時(shí)攝像機(jī) ， 是完善的細(xì)胞培養(yǎng)和觀察監(jiān)視系統(tǒng) （ 光源在上 ， 目鏡在下 ） 、 （ 培養(yǎng)皿 ，瓶中活細(xì)胞生長(zhǎng)生活情況 ） 。 圖 211 萊卡倒臵顯微鏡 ? : ? 是另一種不需染色而直接觀察活細(xì)胞中精細(xì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)設(shè)備 ， 其分辨力比普通光鏡提高一個(gè)數(shù)量級(jí) 。 圖 210 DIC 顯微鏡下的硅藻（偽彩色） ? : ? 激光共焦點(diǎn)顯微鏡的物鏡和聚光鏡是聚集同一焦點(diǎn)能排除平面以外熒光干擾 ， 所以其分辨率比普通熒光顯微鏡提高 ~倍 ， 還可以 “ 光學(xué)切片 ” 方式觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu) 。 圖 25 激光共聚焦掃描顯微鏡 圖 26 LCSM 照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管 （ 二 ） 電子顯微鏡 ? 1 、 透 射 電 鏡 （ transmission electron microscope,TEM） ? 透射電鏡的放大原理與光鏡基本類似 ， 只不過(guò)是以電子槍所發(fā)射的高速電子流代替了照明光源 ， 又以三組電磁線圈所構(gòu)成的磁透鏡代替了玻璃制成的聚光鏡 、 物鏡和目鏡 。 ? 第一組磁透鏡能將電子流聚焦到樣品上 （ 故稱為會(huì)聚鏡 ） ；第二組磁透鏡能使穿透過(guò)樣品的電子射線折射形成初級(jí)放大像 （ 稱為物鏡 ） ；而第三組磁透鏡則是通過(guò)第一第二中間鏡和投影鏡進(jìn)行連續(xù)三次的再放大 ， 最終投射到熒光屏上 ， 使電子圖象轉(zhuǎn)變成了可見的光學(xué)圖象 。 圖 212 JEM1011 透射電子顯微鏡 圖 213 萊卡超薄切片機(jī) 圖 214 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色） ? 特點(diǎn)： ? （ 1）照明光源不同； ? （ 2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同，是依靠改變磁透鏡的微磁電流強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的，也就是說(shuō)，電流強(qiáng)度的變化引起了磁場(chǎng)強(qiáng)度的改變，而磁場(chǎng)強(qiáng)度的變化又使電子射線的折射程度發(fā)生改變，因而放大倍數(shù)即隨之出現(xiàn)變化； ? （ 3）有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)，電子流的發(fā)射速度及波長(zhǎng)皆取決于電壓的高低。 通常透射電鏡的電壓達(dá)幾萬(wàn) —— 十幾萬(wàn)伏的高壓； ? （ 4）有高度真空的工作系統(tǒng)。因?yàn)楦咚龠\(yùn)動(dòng)的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞就會(huì)改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊，故要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水（真空中水易蒸發(fā) or升華，電子流與水分子相碰，改變其方向，使成像模糊）因此說(shuō)透鏡電鏡不能用來(lái)觀察活的樣品； ? （ 5）樣品厚度必須 900（即 90nm,） 這是因?yàn)殡娮哟┩改芰τ邢蓿瑯悠愤^(guò)厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會(huì)產(chǎn)生熱量，將原樣品燒出白斑，所以透鏡電鏡觀察的樣品須超薄切片（ 400~500）不能用普通電鏡下的組織切片（ 2~7um）； ? （ 6） 標(biāo)本染色技術(shù)不同，電鏡標(biāo)本染色并不像光鏡標(biāo)本染色上各種顏色，而是使觀察的結(jié)構(gòu)與背景之間，黑白對(duì)比分明，反差強(qiáng)。所以電鏡標(biāo)本染色劑大多是重金屬鹽類。染色方法有正染、負(fù)染兩類，正染常采用醋酸鈾或檸檬酸鉛染色，使得被觀察的結(jié)構(gòu)較暗，背景較亮；負(fù)染則是使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結(jié)構(gòu)顯得明亮突出； ? （ 7）特殊的投影技術(shù)（真空噴鍍法）是對(duì)電鏡標(biāo)本的表面處理技術(shù)，即以真空噴鍍儀在真空條件下，將金、鉑等金屬微粒傾斜地噴向標(biāo)本，使其朝向發(fā)射原的表面沉積的金屬微粒多于背面，因而電鏡觀察時(shí)感覺反差極強(qiáng)，具立體感。 （ 8） 冰凍蝕刻 （ 或冰凍斷裂 ） 技術(shù) freeze etching or freezefracture 是研究細(xì)胞各種膜相結(jié)構(gòu)的處理方法 ， 先將樣品放入 190℃ 低溫下迅速冰凍 ， 再在真空中用冷卻刀切割斷裂 ， 隨后上升溫度 ， 讓冰在真空中升華成水汽跑掉 ，斷裂面的細(xì)微結(jié)構(gòu)暴露出來(lái) ， 再用真空噴鍍儀在斷面上噴一層碳膜或鉑 —— 碳膜 （ 稱為 “ 表面復(fù)型膜 ” ） 然后拿出真空之外 ， 用有機(jī)溶劑將樣品溶解掉 ， 臵 “ 表面復(fù)型膜 ”于銅網(wǎng)上 ， 即可上電鏡觀察了 ， 因此 ， 電鏡下看到的實(shí)際上已不是樣品本身 ， 而是樣品某一斷裂面的 “ 人工復(fù)制品 ” ， 這是因?yàn)槿藶榈倪@種表面變型膜能比生物樣品本身有更強(qiáng)的電子反差性能 ， 能夠以富有立體感的浮雕形式精細(xì)地反映出某一斷裂的細(xì)微結(jié)構(gòu) 。 對(duì)于 “ 冰凍蝕刻處理的生物膜各個(gè)面 ， 國(guó)際上統(tǒng)一 （ 規(guī)定命名稱為 PS” 代表面向細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的表面 ） 。 圖 215 肌動(dòng)蛋白纖維的負(fù)染電鏡照片 圖 216 冰凍蝕刻電鏡照片 ? 2 、 掃描電鏡 （ scanning electron microscope SEM） ： ? 工作原則不同于透射電鏡 ， 是以電子束在樣品表面掃描 ， 用閃爍器收集樣品表面散射回來(lái)的二次電子信號(hào) ， 再經(jīng)放大 ， 最后在熒光屏上顯示圖像 。 ? 特點(diǎn)：不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜處理 ， 即可觀察標(biāo)本的原始外表面 。 圖 217 JEOL 掃描電子顯微鏡 ? 優(yōu)點(diǎn)： ? （ 1） 可觀察較大 ， 較厚的樣品 ? （ 2） 景深大 （ 景深 —— 聚焦后能清晰看到物象的前后距離范圍 ） ， 所以圖像是十分逼真的三維立體形象 ? （ 3） 其放大倍數(shù)是從 20~20萬(wàn)倍的連續(xù)變倍 ， 不須重復(fù)多次對(duì)焦 ， 故對(duì)觀察研究很方便 ? （ 4） 樣品可在樣品室內(nèi)做多方位的水平移動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng) ，便于從各個(gè)角度來(lái)觀察樣品的全貌 。 ? 缺點(diǎn)： ? （ 1） 分辨力不太高 ， 僅 3~10nm ? （ 2） 不能觀察樣品內(nèi)部 。 圖 218 光學(xué)顯微鏡、 TEM、 SEM 成像原理比
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